Laboratorium Biofizyki Molekularnej
Zarys teorii statycznego rozpraszania
ś
wiatła (static light scattering,
Rayleigh light scattering).
Światło padające na roztwór cząsteczek rozprasza się we wszystkich kierunkach
(Rys.1.). W momencie kiedy fala elektromagnetyczna oddziaływuje z konkretną drobiną,
orbity elektronowe cząsteczki doznają okresowych perturbacji, z częstością równą częstości
oscylacji pola elektromagnetycznego fali padającej. Te perturbacje czy oscylacje zwane
indukowanym momentem dipolowym, są przejawem promieniowania elektromagnetycznego ,
wynikającego z rozpraszania światła. Większość światła rozproszonego emitowanego przez
drobinę ma częstotliwość równą częstotliwości światła padającego – taki proces nazywany
jest elastycznym rozpraszaniem światła.
światłorozproszone
światłopadające
Rys.1. Rozpraszanie światła padającego na cząsteczkę w roztworze lub w próŜni.
NatęŜenie światła rozproszonego zaleŜy od polaryzowalności cząsteczek
(definiowanej jako zdolność chmury elektronowej cząsteczek do odkształceń pod wpływem
pola elektrycznego padającej fali świetlnej), która zaleŜy od masy cząsteczkowej. Tak więc
światło rozproszone staje się cennym narzędziem w pomiarach masy cząsteczkowej.
NatęŜenie światła rozproszonego będzie zaleŜało od średniej waŜonej masy cząsteczkowej,
jak równieŜ bezpośrednio od rozmiarów cząsteczki. Dlatego dla roztworów polimerów mierzy
się tzw. promień bezwładności (ang. radius of gyration). Ponadto pomiary przeprowadza się
zazwyczaj dla roztworów niedoskonałych, rzeczywistych (ang. non-ideal solutions)
oddziałujących ze sobą cząsteczek, co pozwala określić współczynnik wirialny A
2
.
Eksperymenty oparte na zjawisku rozpraszania światła pozwalają mierzyć trzy wielkości:
średnią waŜoną masę cząsteczkową molekuły (M
W
), średni kwadrat promienia bezwładności
(<r
g
2
>) oraz drugi współczynnik wirialny (A
2
).
Klasyczna teoria rozpraszania światła według Rayleigha dotyczy małych cząsteczek, tzn.
takich, których rozmiar jest duŜo mniejszy od długości fali światła ulegającego rozproszeniu:
2
r
<
l
/20.
(1)
Zakres światła widzialnego obejmuje obszar pomiędzy 4000Å a 8000Å, dlatego pierwiastek
ze średniego kwadratu promienia bezwładności powinien być mniejszy od 200 –400 Å .
Rozpraszanie światła na cząsteczkach optycznie duŜych opisane jest przez teorię Rayleigha-
Gansa. W tym przypadku dokonuje się korekcji polegającej na ekstrapolacji natęŜenia światła
rozproszonego do zerowego kąta rozpraszania. Z nachylenia tej zaleŜności otrzymuje się
1
średnią z kwadratu promienia bezwładności cząsteczki. Natomiast, aby pozbyć się efektu
związanego z oddziałującymi ze sobą cząsteczkami w roztworze (non-ideal solution), naleŜy
przeprowadzić ekstrapolację do zerowego stęŜenia roztworu. Wówczas nachylenie takiej
zaleŜności da nam drugi współczynnik wirialny A
2
, a przecięcie z osią rzędnych pozwoli
wyznaczyć średnią waŜoną masy cząsteczkowej M
w
.
spolaryzowaneświatło
padające
Rys.2. Światło padające na małą cząsteczkę spolaryzowane w kierunku z.
Światło jest falą elektromagnetyczną, której wektor natęŜenia pola elektrycznego zaleŜy od
czasu w następujący sposób:
2
p
ct
E
z
=
E
cos
(2)
0
l
gdzie
E
0
jest amplitudą pola elektrycznego,
c
jest prędkością światła, a
jest długością fali
świetlnej,
E
z
oznacza płaszczyzn
ę
polaryzacji
ś
wiatła padaj
ą
cego (kierunek
z
).
Pole
elektryczne fali padającej indukuje w cząsteczce moment dipolowy
p
, który zaleŜy od
wielko
ś
ci tego pola oraz od polaryzowalno
ś
ci cz
ą
steczki
a
p
:
l
2
p
ct
p
=
a
E
cos
(3)
p
0
l
Oscylujący indukowany moment dipolowy będzie wypromieniowywał światło we wszystkich
kierunkach. Takie światło rozproszone obserwowane będzie w odległości
r
od objętości
rozpraszającej, pod kątem q
z
do kierunku pierwotnej polaryzacji
z
. Pole elektryczne światła
rozproszonego jest proporcjonalne: do drugiej pochodnej momentu dipolowego po czasie,
czyli do przyśpieszenia ładunku dipola, (1/c
2
)(d
2
p/dt
2
), do 1/r (pole elektromagnetyczne
maleje jak 1/r) oraz do sin
z
(który jest rzutem momentu dipolowego na kierunek obserwacji
światła rozproszonego). Reasumując pole elektryczne światła rozproszonego pod kątem q
z
wyraŜa się wzorem:
q
2
2
2
1
1
d
p
1
4
p
c
2
p
ct
E
=
=
a
E
sin
q
cos
.
(4)
s
p
0
z
r
c
2
dt
2
c
2
r
l
2
l
Aparatura mierząca światło rozproszone jest wraŜliwa jedynie na natęŜenie światła
rozproszonego I
s
, które jest równe kwadratowi amplitudy pola elektrycznego fali:
4
16
p
2
2
I
=
a
I
sin
q
,
(5)
s
p
0
z
z
2
4
r
l
2
gdzie
I
0z
jest nat
ęŜ
eniem
ś
wiatła
padaj
ą
cego spolaryzowanego
w kierunku
z
, I
0z
=E
0
2
.
W przypadku, gdy w eksperymencie uŜywane jest światło
padaj
ą
ce
niespolaryzowane
,
wówczas natęŜenie światła padającego przedstawione jest jako suma
jednakowych składników natęŜeń światła spolaryzowanego w kierunku
z
i w kierunku
y
:
1
1
I
=
I
+
I
.
(6)
0
0
z
0
y
2
2
Natomiast natęŜenie światła rozproszonego będzie miało postać:
(
4
2
8
p
a
1
1
)
p
2
2
I
=
I
+
I
=
I
sin
q
+
sin
q
,
(7)
s
sz
sy
0
z
y
2
4
2
2
r
l
gdzie
q
y
jest kątem jaki tworzy kierunek obserwacji światła rozproszonego z osią
y.
spolaryzowaneświatło
padające
x
Rys.3. Kierunek obserwacji światła rozproszonego na cząsteczce tworzy kąt
q
z
z kierunkiem
osi
z.
Odległość detektora od punktu rozpraszania wynosi
r.
Rozpraszanie światła niespolaryzowane ilustruje rysunek 4.
y
niespolaryzowaneświatło
padające
x
Rys.4. W analizie rozproszonego światła niespolaryzowanego brane jest pod uwagę światło
padające spolaryzowane w kierunku z oraz w kierunku y.
3
Istnieje geometryczny związek pomiędzy kosinusami kierunkowymi kątów
q
y
,
q
z
oraz
kątem q
x
, który będziemy teraz oznaczać po prostu q :
1
2
2
2
cos
q
+
cos
q
+
cos
q
=
(8)
x
y
z
A stąd mamy
2
2
2
sin
q
+
sin
q
=
1
+
cos
q
(9)
y
z
Jeśli źródłem rozpraszania jest n moli
małych
cząsteczek lub nN
A
cząsteczek w
rozcieńczonym roztworze o objętości V, wówczas natęŜenie światła rozproszonego pod katem
q
będzie miało wartość:
4
2
8
p
a
I
nN
(
)
( )
p
2
I
q
=
0
A
1
+
cos
q
(10)
s
2
l
4
V
r
Jak widać natęŜenie światła rozproszonego zaleŜy od kąta rozpraszania i kształt tej zaleŜności
determinuje człon (1+cos
2
). Najsilniej światło rozpraszane jest pod kątem 0 stopni, a
najsłabiej pod kątem 90
o
, światło rozproszone pod kątem q oraz kątem 180
o
-q , ma tę samą
wartość. NatęŜenie światła rozproszonego jest odwrotnie proporcjonalne do czwartej potęgi
długości fali padającej.
Praktyczny związek pomiędzy natęŜeniem światła rozproszonego a masą cząsteczkową
polimeru w roztworze bierze się stąd, iŜ polaryzowalność optyczna cząsteczki zaleŜy od jej
masy cząsteczkowej. W pierwszym przybliŜeniu polaryzowalność moŜe być traktowana jako
róŜnica we współczynniku załamania pomiędzy cząsteczkami polimeru a rozpuszczalnikiem.
Innymi słowy , światło rozpraszane jest wtedy, gdy ośrodek wykazuje niejednorodny
współczynnik załamania światła.
Polaryzowalność cząsteczek w roztworze o stęŜeniu c będzie wyraŜać się będzie
następującym wzorem:
q
n
cV
dn
a
=
0
0
(11)
p
2
p
nN
dc
A
gdzie n jest ilością moli cząsteczek, n
0
jest współczynnikiem załamania światła roztworu,
dn
0
/dc opisuje inkrement współczynnika załamania światła roztworu. Jeśli współczynnik
załamania światła dla rozpuszczalnika oraz dla polimeru jest taki sam, wówczas dn
0
/dc będzie
równe zeru, nie będzie polaryzowalności , a co za tym idzie nie będziemy obserwować
światła rozproszonego. Podstawiając za stęŜenie wyraŜone w g/ml c=nM/V, moŜemy zapisać
polaryzowalność w postaci:
n
M
dn
a
=
0
2p
0
(12).
p
N
dc
A
Wzór (10) na natęŜenie światła rozproszonego dla
niespolaryzowanej fali padaj
ą
cej
wobec
powyŜszego przyjmie postać:
( )
2
2
2
0
I
q
2
p
n
dn
(
)
2
s
=
0
Mc
1
+
cos
q
.
(13)
2
4
I
r
l
N
dc
0
A
Przyjmijmy, Ŝe I
0
, r będą stałe, natomiast I
s
(
) będzie wielkością mierzoną. Aby uniezaleŜnić
się od natęŜenia światła padającego I
0
oraz od odległości objętości rozpraszającej od
detektora r, wprowadza się wielkość zwaną współczynnikiem Rayleigha R:
q
( )
r
2
I
q
( )
R
q
=
s
(14).
I
0
Z równania na natęŜenie światła rozproszonego dostaniemy:
( )
R
q
=
KcM
(15)
4
gdzie K (tutaj dla fali
padaj
ą
cej niespolaryzowanej
) jest stałą optyczną wyraŜoną w
następujący sposób:
2
2
2
0
2
p
n
dn
(
)
2
K
=
0
1
+
cos
q
(16)
4
l
N
dc
A
Stała K zaleŜy od właściwości roztworu, długości fali światła padającego
l
, kąta rozpraszania
q
; jest stałą układu niezaleŜną od stęŜenia i masy cząsteczkowej polimeru.
Dla fali padającej
spolaryzowanej liniowo w kierunku z
, stała optyczna K będzie miała
postać (na podstawie analogicznych obliczeń jak dla fali padajacej niespolaryzowanej):
2
2
2
0
4
p
n
dn
(
)
2
K
=
0
1
+
cos
q
(17).
4
l
N
dc
A
Obliczenia masy cz
ą
steczkowej M
w
albuminy z na podstawie warto
ś
ci
nat
ęŜ
enia
ś
wiatła rozproszonego I
s
.
NatęŜenia światła rozproszonego jest proporcjonalne do średniego kwadratu fluktuacji
stęŜenia roztworu makrocząsteczek białka oraz odwrotnie proporcjonalne do gradientu
ciśnienia osmotycznego :
-1
¶
(
)
2
I
@
D
c
@
¶
c
P
RT
=
+
B
c
+
B
c
2
2
3
c
M
w
Według dipolowo-relaksacyjnej teorii Debye’a natęŜenie światła rozproszonego przez
rozcieńczone roztwory polimerów wyraŜa się następująco:
(
)
I
c
1
+
cos
2
q
s
=
K
I
1
0
2
3
r
+
2
B
c
+
3
B
c
+
...
2
3
M
w
gdzie I
S
jest natęŜeniem światła rozproszonego, I
0
jest natęŜeniem światła padającego, K jest
stałą optyczną, r jest odległością detektora od objętości rozpraszającej, c jest stęŜeniem
makrocząsteczek w roztworze, B oznacza współczynniki wirialne,
jest kątem pod jakim
obserwujemy światło rozproszone, a M
W
jest masą cząsteczkową makromolekuły.
q
Wzór powyŜszy moŜna zapisać, upraszczając:
5