http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab4.html
ZAKOWAIE W CELU WIZUALIZACJI WYIKU
Wiele metod biologii molekularnej opiera się na wykorzystaniu wyznakowanych cząsteczek
kwasów nukleinowych. Dobra sonda powinna mieć wysoką aktywność , odpowiednią
czystość i specyficzność. Najpowszechniej wykorzystywane do znakowania są cząsteczki
nukleotydów, w których jeden z atomów zastąpiony został izotopem radioaktywnym.
Aktywność specyficzna zależy od proporcji włączonych nukleotydów radioaktywnych do
normalnych. Krótszy okres półtrwania izotopu również powoduje zwiększenie aktywności
specyficznej. Najczęściej stosowane są dwa izotopy : fosfor
32
P (włączany w pozycji a lub g
cząsteczki trifosforanu nukleotydu) oraz siarka
35
S (włączana w miejsce atomu tlenu
odpowiedniej reszty fosforanowej a lub g). Fosforu radioaktywnego używa się gdy
wymagane jest uzyskanie sondy o wysokiej aktywności co zapewnia dużą czułość i krótki
czas detekcji. Podstawowym zastosowaniem siarki jest sekwencjonowanie DNA a także
badanie metabolizmu białek.
ajczęściej używane radioizotopy.
Radioizotop
Czas
półtrwania
Energia emitowanych
cząstek (MeV)
Specyficzna aktywność
wyznakowanych składników
(mCi/mmol)
Tryt
12,35 lat
0,0186
10
2
10
5
Węgiel 14 5730 lat
0,156
1 10
2
Siarka 35 87,5 dnia
0,167
1 10
6
Fosfor 33 25,5 dnia
0,248
10 10
4
1 z 3
2010-04-04 13:27
ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab4.html
Fosfor 32 14,3 dnia
1,709
10 10
5
* MeV = 10
6
elektronowoltów. Powyżej podana maksymalna energia.
#
mCi (miliCurie) miara liczby rozpadów na jednostkę czasu. 1 mCi = 2,2
.
10
9
rozpadów na minutę.
W zależności od konkretnego zastosowania stosuje się różne metody znakowania DNA :
ick translation DNaza I wprowadza do cząsteczki jednoniciowe pęknięcia (nick).
Polimeraza I dzięki swojej aktywności 5`3` egzonukleazy usuwa nukleotydy przed
sobą a za sobą dobudowywuje nowe włączając między innymi również nukleotydy
radioaktywne. W ten sposób przesuwa niejako miejsce pęknięcia. Wydajność
inkorporacji wynosi około 50%. Metoda ta daje najlepsze wyniki przy znakowaniu
całych plazmidów a nie jest raczej zalecana do fragmentów liniowych.
Random priming najczęstsza , oparta jest na hybrydyzacji oligonukleotydów (6 do
9 nukleotydów) o przypadkowej sekwencji do DNA , który ma być wyznakowany.
Następnie polimeraza Klenowa (fragment polimerazy DNA I nie posiadający
aktywności egzonukleolitycznej 5`3`) dosyntetyzowuje komplementarną nić DNA
poczynając od 3` OH końca przyłączonego startera. W mieszaninie reakcyjnej
znajdują się także radioaktywne nukleotydy włączane stopniowo do nowo
syntetyzowanej nici. Długość znakowanych fragmentów nie wpływa na wydajność
reakcji. Można w ten sposób uzyskać sondę o wysokiej aktywności. Metoda jest
doskonała zarówno do znakowania całych plazmidów jak i liniowych fragmentów.
Znakowanie DA na końcach.
Znakowanie 5` końca.
W tej metodzie używa się kinazy polinukleotydowej faga T4 , która przenosi grupę
fosforanową z pozycji g ATP na DNA lub RNA zawierające grupę hydroksylową na
5` końcu.
Ponieważ normalnie cząsteczki DNA zawierają grupę fosforanową na 5` końcu
należy przed znakowaniem poddać je działaniu alkalicznej fosfatazy , która
spowoduje jej usunięcie. Metoda najczęściej stosowana do znakowania syntetycznych
oligonukleotydów.
Znakowanie 3` końca.
Terminalna transferaza dołącza deoksyrybonukleotydy na 3` końcu. Nie wymaga
matrycy. Substratem dla tego enzymu może być zarówno jednoniciowe jak i
dwuniciowe DNA.
Wypełnianie lepkich końców. W tej metodzie używa się fragmentu Klenowa , który
dobudowuje brakujące na 3` końcu nukleotydy w cząsteczkach strawionych
enzymami restrykcyjnymi tworzącymi lepkie końce 5`. Wydajność inkorporacji sięga
niekiedy nawet 90%.
Po znakowaniu niezbędne jest oddzielenie niewłączonych radioaktywnych dNTP ,
2 z 3
2010-04-04 13:27
ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab4.html
które mogłyby ujemnie wpływać na jakość hybrydyzacji dając zbyt wysokie tło czyli
zmniejszając specyficzność reakcji. Rozdzielenie uzyskuje się przez sączenie na
kolumienkach ze specjalnym złożem , które zatrzymuje związki drobnocząsteczkowe
przepuszczając makrocząsteczki.
Ilościowe oznaczenie wyznakowania osiąga się przez pomiar aktywności sondy. Jest
on możliwy za pomocą dwóch urządzeń : licznika Geigera i licznika scyntylacyjnego .
Zliczają one zarejestrowane rozpady promieniotwórcze w jednostce czasu. Jednostką
podstawową jest cps (counts per second) zliczenie na sekundę lub dpm
(disintegrations per minute) liczba rozpadów promieniotwórczych na minutę.
Wykrywanie wizualne wyznakowanych cząsteczek w celu zlokalizowania prążka ,
który z sondą zhybrydyzował jest możliwe dzięki autoradiografii. Starszą metodą jest
poddanie naświetlaniu kliszy pokrytej emulsją fotograficzną czułą na
napromieniowanie w specjalnych kasetach. Klisza położona na filtr ulega
zaczernieniu w miejscu hybrydyzacji z sondą. Kasetę taką przechowuje się przez
pewnien czas , odwrotnie proporcjonalny do aktywności sondy , w temperaturze
70°C. Niska temperatura sprzyja ostrości prążków. Następnie klisza jest
wywoływana. Nowszą metodą jest ekspozycja filtru w innych kasetach. Jest tu
niezbędne specjalne urządzenie tzw. phosphoimager sprzężony z komputerem , który
umożliwia zeskanowanie powierzchni kasety i obróbkę uzyskanych w ten sposób
danych. Przy pomocy programu komputerowego Image Quant jesteśmy w stanie
oszacować nawet intensywność zaczernienia.
TECHNIKA WESTERN BLOT
ELEKTROFOREZA WĘDRÓWKA W ŻELU
(c) 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie
Webmaster
3 z 3
2010-04-04 13:27