ZW2013-09-01, Studia, IV ROK, Bydło, Zakaźne, Egzamin z Zakazów

//-->.pos {position:absolute; z-index: 0; left: 0px; top: 0px;}Prace poglądowePrzegląd metod przydatnychdo laboratoryjnej diagnostykiafrykańskiego pomoru świń –możliwości i ograniczeniaIwona Markowska-Daniel, Edyta Kozakz Krajowego Laboratorium Referencyjnego ds. ASF Zakładu Chorób Świń PaństwowegoInstytutu Weterynaryjnego – Państwowego Instytutu Badawczego w PuławachSurvey of the methods useful for laboratorydiagnosis of African swine fever – theirbenefits and limitationsMarkowska-Daniel I., Kozak E.,Departmentof Swine Diseases, National Veterinary ResearchInstitute, PulawyThe aim of this paper was to review and evaluate di-agnostic methods used for African swine fever (ASF).Due to the unfavorable epidemiological situation ofASF in Eastern Europe, this disease is considered asthe global pig health priority. Laboratory diagnosis ofASF is a core for contingency plans and disease eradi-cation. The serious risk of ASF virus transmission fromBelarus or Russian Federation has forced high levelof diagnostic preparedness in our country. Therefore,the overview of the diagnostic methods enabling thedetection of antigens, antibodies or genetic materi-al of ASFV, with special emphasis to their advantag-es and limitations was prepared. The choice of thesuitable technique depends on the aim of the study,costs, current epidemiological situation and biosafe-ty laboratory conditions. Serological studies are jus-tified due to the possibility of early detection of an-tibodies in animals suspected of being infected andthe monitoring of the virus carriers. However, serolog-ical methods are not accurate and results obtainedoften must be confirmed by more specific and sen-sitive techniques. In recent years techniques of mo-lecular biology are increasingly used, allowing une-quivocal, very early identification of ASF virus. The re-al-time PCR, which allows simultaneous, quantitativereading results is used as the only method of choice.Taking presented facts into account it is recommend-ed to perform serological and virological tests simul-taneously. Since the ASF virus can be present in thepig blood/serum from 2ndday post infection till death,the laboratory diagnosis should be performed underproper biosafety conditions to avoid the environmentcontamination and spread of the virus throughout thecountry with diagnostic samples.Keywords:African swine fever, serology, molecularbiology techniques.Badania serologiczne, mimo iż mogąwykazywać pewien odsetek wyników fał-szywie dodatnich i ujemnych, z uwagi namożliwość jednoczesnej analizy dużej licz-by próbek pochodzących od różnych zwie-rząt, krótki czas i łatwość wykonania orazniski koszt są wykonywane najczęściej. Sąone przydatne do wykrywania zwierząt po-dejrzanych o zakażenie, rozpoznawania po-dostrej i przewlekłej postaci choroby orazdo monitorowania obecności nosicieli wi-rusa (1, 6). Aktualnie do tego celu wyko-rzystywane są następujące techniki: ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), im-munoblotting (IB), test immunoperoksy-dazowy (immunoperoxidase test – IPT)oraz test pośredniej immunofluorescen-cji (indirect immunofluorescence, IIF – 7).Afrykański pomór świń (African swinefever – ASF) jest obecnie uważany zanajgroźniejszą chorobę zwierząt z rodzi-ny świniowatych (Suidae). Od 2007 r. sy-tuacja epidemiologiczna w zakresie afry-kańskiego pomoru świń, zwłaszcza nawschodzie Europy, jest bardzo niekorzyst-na. W związku z ostatnimi ogniskami cho-roby u świń w Rosji, na Ukrainie i Białoru-si należy uznać, że Polska znalazła się ak-tualnie w strefie realnego zagrożenia ASF.Podstawą monitorowania sytuacji epi-demiologicznej, kontrolowania nowychognisk oraz zwalczania afrykańskiego po-moru świń jest szybkie i pewne laborato-ryjne rozpoznanie choroby (1, 2, 3). Z tegopowodu celowe wydaje się przybliżenie le-karzom wiedzy na temat możliwości i ogra-niczeń wybranych technik przydatnychdo laboratoryjnej diagnostyki tej choroby.Materiał do badańNależy pamiętać o  fundamentalnej zasa-dzie: badanie laboratoryjne zaczyna się jużw chlewni. Stąd bardzo duże znaczenie madbałość o właściwy dobór i pobór próbek(rodzaj i liczba próbek oraz czas od zaka-żenia do ich pobrania). Materiał do badańdiagnostycznych w kierunku afrykańskie-go pomoru świń może być pobierany przy-życiowo (krew) lub pośmiertnie (wycinkitkanek). Optymalnymi narządami do ba-dań wirusologicznych są: krew oraz węzłychłonne, nerka i śledziona, które powinnybyć pobrane od co najmniej dwóch zwie-rząt padłych lub zabitych w szczycie cho-roby. Bardzo istotne jest, aby materiał dobadań pobrany był w sposób możliwie ste-rylny, do plastikowych lub szklanych szczel-nie zamkniętych pojemników, a następniew stanie schłodzonym szybko dostarczonydo laboratorium. W przypadku próbek krwinależy dodać środki zapobiegające krzepli-wości (np. EDTA lub heparynę) i dokładniewymieszać zawartość probówki. Z kolei dowykrycia obecności przeciwciał wykorzy-stuje się surowicę, która powinna być po-brana od świń podejrzanych o zakażenie,chorujących najdłużej (4, 5). Krew do ba-dań serologicznych powinna być pobranaŻycie Weterynaryjne • 2013 • 88(9)do probówek bez dodatku EDTA, odwiro-wana celem uzyskania surowicy, a następnieschłodzona lub zamrożona i przesłana dobadań. Bardzo ważne jest prawidłowe ozna-kowanie i zapakowanie próbek przed ichtransportem. Każda próbka powinna byćzapakowana oddzielnie i posiadać czytelnąetykietę zawierającą numer identyfikacyjnyzwierzęcia, rodzaj próbki oraz datę i miej-sce pobrania (1). Szczegółowa informacjaodnośnie do zasad pobierania, pakowaniai transportu próbek do badań w kierunkuafrykańskiego pomoru świń wykonywa-nych w Krajowym Laboratorium Referen-cyjnym ds. ASF w Państwowym InstytucieWeterynaryjnym – Państwowym Instytu-cie Badawczym znajduje się na stronie In-stytutu (www.piwet.pulawy.pl).Aktualnie dysponujemy panelem sze-regu metod przydatnych do laboratoryj-nego rozpoznania afrykańskiego pomoruświń. Pozwalają one na wykrycie antyge-nu, przeciwciał lub materiału genetycz-nego wirusa.Badania serologiczneW przebiegu afrykańskiego pomoru świńwirus znajduje się w  krwiobiegu niemalprzez całe życie zakażonych świń, począwszyod około 2 dnia po zakażeniu (d.p.z.), a prze-ciwciała syntetyzowane są niezwykle szyb-ko – przeciwciała klasy IgM można wykryćjuż od około 4 d.p.z., a wtórną odpowiedźhumoralną, czyli obecność IgG, można po-twierdzić od około 7–10 d.p.z. Przeciwcia-ła utrzymują się bardzo długo, maksymal-ną ich ilość odnotowuje się w 5–6 tygodniu,równocześnie we krwi można stwierdzićobecność wirusa (1). Zatem krew pobranapo okresie inkubacji, po wystąpieniu pierw-szych objawów wskazujących na zakażeniewirusem afrykańskiego pomoru świń jestpróbką optymalną, zarówno do badań wi-rusologicznych, jak i serologicznych. W tymmiejscu należy zwrócić uwagę na fakt, żepróbki krwi (surowic) należy traktować jakomateriał potencjalnie wysoce zakaźny, któ-ry powinien być badany w laboratoriach po-siadających odpowiedni stopień zabezpie-czenia biologicznego.745Prace poglądoweELISA jako technika prosta, specyficz-na, czuła, szybka, ekonomiczna, umożli-wiająca łatwą interpretację wyniku, zna-lazła zastosowanie na dużą skalę. Pozwalaona na osiągnięcie bardzo dobrej powta-rzalności i odtwarzalności. Najczęściej sto-suje się test pośredni, w którym mikropłyt-ka opłaszczona jest antygenem (zwykle jestto białko VP73), uzyskanym w komórkachnerki małpy (monkey stable kidney cell line– MS), zainfekowanych szczepem hiszpań-skim (E70) wirusa afrykańskiego pomoruświń. Jako koniugat stosowane jest przeciw-ciało monoklonalne (monoclonal antibody –Mab) wyznakowane peroksydazą. W przy-padku obecności przeciwciał w  badanejpróbce dochodzi do utworzenia komplek-su antygen-przeciwciało, do którego następ-nie przyłącza się koniugat. Po wypłukaniui dodaniu substratu (najpowszechniej sto-sowanym substratem jest DMAB/MBTH)obserwuje się reakcję barwną, która wska-zuje na obecność przeciwciał. Natężeniebarwy jest proporcjonalne do stężenia im-munoglobulin. Aby dokładnie określić stę-żenie przeciwciał, konieczne jest spektro-fotometryczne odczytanie absorbancji przyokreślonej długości fali, zależnej od substra-tu, za pomocą automatycznych czytnikówdo ELISA. Badanie trwa ok. 3 godzin. Czu-łość i specyficzność testu przyjmuje odpo-wiednio wartości ok. 95,8% i 97,3% (7). Pani wsp. (8) wykazali, że dzięki zastosowaniutestu ELISA można rozpoznać ok. 6% więcejzwierząt zakażonych, w porównaniu z im-munoelektroosmoforezą (immunoelektro-osmophoresis – IEOP).W celu potwierdzenia dodatniego wy-niku w teście ELISA w krajach wolnych odafrykańskiego pomoru świń oraz wynikuwątpliwego na obszarach endemicznegowystępowania choroby, można stosowaćróżne metody, m.in. IIF, opartą na połą-czeniu technik histologicznych i  immu-nologicznych (7, 9, 10). Technika ta skła-da się z dwóch etapów. W pierwszej fazieantygen łączy się z przeciwciałami obec-nymi w badanej próbce, natomiast w dru-giej powstałe kompleksy antygen-przeciw-ciało są wykrywane za pomocą przeciwciałdrugorzędowych znakowanych barwni-kami fluoroscencyjnymi. Najczęściej sto-sowany jest izotiocyjanian fluoresceiny(FITC), który po wzbudzeniu emituje ko-lor zielony. Wynik badania odczytuje sięprzy użyciu mikroskopu fluorescencyj-nego. Można go uzyskać w czasie od kil-ku godzin do 2 dni. IIF wykazuje większączułość niż technika bezpośrednia stoso-wana do wykrycia antygenów wirusa afry-kańskiego pomoru świń (7, 10). Pan i wsp.(8) porównali czułość i swoistość IIF do in-nych metod. Badania wymienionych auto-rów dowiodły, że IIF jest bardziej czuła niżELISA (zgodność wynosiła 86%) i zbliżonado IPT (zgodność wynosiła 98%).Dobrą alternatywą dla IIF jest IB –test zalecany przez OIE i wykorzystywa-ny w  Krajowym Laboratorium Referen-cyjnym ds. ASF (10). W pierwszym etapie– elektroforezie w warunkach denaturują-cych, białka są rozdzielane pod wpływemprądu elektrycznego, zależnie od ich masymolekularnej. Na żelu poliakrylamidowymprzybierają one postać prążków. Kolejnosą one przenoszone na membranę nitro-celulozową pod wpływem napięcia prą-du stałego, przy zastosowaniu stężonychbuforów niskojonowych. Bufory wysoko-jonowe nie są wykorzystywane ze wzglę-du na dużą emisję ciepła (7, 11). Następ-nie z membrany wycinane są paski, którepoddawane są wysycaniu, najczęściej 2%mlekiem w proszku, w celu zablokowaniawszystkich miejsc niezwiązanych. Doda-tek badanej surowicy z zawartymi w niejprzeciwciałami sprawia, że wiążą się onez odpowiednim antygenem. Po odpłukaniunadmiaru przeciwciał dodawany jest koniu-gat (przeciwciało drugorzędowe wyzna-kowane peroksydazą). Powstające immu-nokompleksy uwidaczniają się pod wpły-wem substratu – 4-chloro-1-naftolu (7).Wynik badania odczytuje się, porównu-jąc wzór białkowy i intensywność koloruprążków do kontrolnych surowic dodat-nich (9). Podczas opracowywania testu IBprzeprowadzono wiele badań nad zasto-sowaniem odpowiednich filtrów oraz bu-forów blokujących. Najlepsze właściwościjako membrana wykazywała nitroceluloza,polidifluorek (PVD) i nylon dawały wyż-sze tła. Spośród buforów blokujących naj-bardziej użyteczne okazało się 2% mlekow proszku (12). IB posiada wiele zalet, dla-tego jest powszechnie stosowany jako me-toda potwierdzająca obecność przeciwciałswoistych dla wirusa afrykańskiego pomo-ru świń. Charakteryzuje się wysoką specy-ficznością i czułością (98%), nawet w krót-kim czasie po zakażeniu (7–9 d.p.z.), umoż-liwia prostą interpretację wyników, lepsząidentyfikację próbek słabo dodatnich orazwykrycie bezobjawowych nosicieli. Bar-dzo ważne jest również to, iż IB jest za-lecany w przypadku próbek źle zachowa-nych, które w ELISA mogą wykazywać ażdo 20% wyników fałszywie dodatnich (7).Ponadto stosowanie pasków antygenowycheliminuje ryzyko przeniesienia czynnikazakaźnego, jak ma to miejsce w przypad-ku rozpuszczalnego antygenu stosowane-go do opłaszczania mikropłytek w  teścieELISA. Paski antygenowe przechowywanew temperaturze pokojowej pozostają stabil-ne przez długi okres (min. 6 miesięcy), bezwpływu na ich przydatność do badań (12).Kolejnym testem potwierdzającym, za-lecanym przez OIE do wykrywania prze-ciwciał przeciwko wirusowi afrykańskiegopomoru świń, jest IPT, który także jest wy-korzystywany w Krajowym LaboratoriumReferencyjnym ds. ASF. Z uwagi na dużączułość i  specyficzność pozwala on po-twierdzić wyniki dodatnie i wątpliwe uzy-skane w ELISA (zgodność wyników wyno-si 87%). W naturalnych warunkach wirusafrykańskiego pomoru świń zakaża ko-mórki układu odpornościowego, mono-cyty oraz makrofagi. IPT oparty jest nazdolności namnażania się wirusa w cyto-plazmie komórek, zwłaszcza linii komór-kowej MS lub Vero, będących źródłemantygenu. Po utrwaleniu płytek i dodaniubadanej surowicy tworzy się kompleks im-munologiczny wykrywany po dodaniu ko-niugatu i substratu (roztworu 3-aminoety-lokarbazolu i dimetyloformamidu). Uzy-skane czerwone zabarwienie cytoplazmykomórek świadczy o wyniku pozytywnym,jasnoróżowe o wątpliwym, a brak zabar-wienia oznacza, że próbka jest ujemna (7).Dużą zaletą IPT jest odczytywanie wyni-ków przy użyciu mikroskopu ze światłembiałym. Pozwala to na przebadanie dużejliczby próbek (nawet do 400 dziennie) (8).Najnowsze doświadczenia wykazały,iż do rozpoznania ASF metodami ELISAi  IPT może być przydatna również ślina(13). Badania Mur i  wsp. (13) dowiodłyjednak, iż przeciwciała w próbkach suro-wic pobranych od świń zakażonych szcze-pem portugalskim NHV/P68 wykrywanow ciągu 8–11 d.p.z., natomiast w ślinie do-piero po upływie 11–30 d.p.z. Pojawieniesię przeciwciał w ślinie było skorelowanez mianem przeciwciał w surowicy (w przy-padku miana poniżej 1:2500 w surowicy,nie wykrywano jeszcze przeciwciał w śli-nie). Ze względu na koszt badań próbekkrwi, a  jednocześnie większą możliwośćrozprzestrzenienia się wirusa podczas jejpobierania, ślina staje się atrakcyjną alter-natywą w programach nadzoru i zwalcza-nia różnych chorób, w tym także afrykań-skiego pomoru świń.Wykrywanie antygenów wirusaafrykańskiego pomoru świńOprócz metod serologicznych w diagno-styce ASF stosowane są badania wiruso-logiczne, mające na celu wykrycie anty-genów wirusa. Do nich należą ELISA an-tygenowa (antigen ELISA), bezpośredniafluorescencja (direct immunofluorescence– DIF) oraz hemadsorpcja (haemadsorp-tion reaction – HAD). Techniką możliwądo zastosowania na dużą skalę, w ostrej po-staci choroby, jest ELISA antygenowa (7).Test przeprowadzany jest w kilku etapach.W pierwszej fazie płytka jest opłaszczanaprzeciwciałem specyficznym dla antygenu.Następnie niezwiązane przeciwciała są od-płukiwane i dodawana jest próbka badana.Jeśli będzie w niej obecny antygen, utwo-rzy on kompleks immunologiczny z prze-ciwciałem. Po kolejnym etapie płukaniaŻycie Weterynaryjne • 2013 • 88(9)746Prace poglądowedodawane jest przeciwciało specyficznedla antygenu, znakowane enzymem – pe-roksydazą chrzanową (koniugat). W kolej-nym etapie do enzymu przyłącza się sub-strat, dając reakcję barwną. Ze względuna brak odpowiedniej czułości metoda niejest przydatna w przypadkach podostrychi przewlekłych, może wówczas dochodzićdo zablokowania oddziaływania antyge-nu z koniugatem poprzez powstałe kom-pleksy immunologiczne antygen-przeciw-ciało (14). Z tego powodu podjęto próbyulepszenia testu. Dowiedziono, iż przygo-towanie antygenu i  zastosowanie odpo-wiednich przeciwciał ma znaczny wpływna poprawę jego swoistości i czułości (15).Vidal i wsp. (15) porównywali nieoczysz-czony antygen (komórki linii Vero zakażo-ne dawką 20 jtk ASFV /komórkę, ekstraktzawierał kilka białek) z częściowo oczysz-czonym (białko VP73) oraz Mabs i prze-ciwciała poliklonalne. Dowiedli, iż w przy-padku częściowo oczyszczonego antygenuaktywność była 200 razy większa. Przeciw-ciała 18BG3 i 17LD3 reagowały z antyge-nem VP73 we wszystkich rodzajach eks-traktów, natomiast 1F8 i 19BA2 posiadałytę właściwość wyłącznie dla nieoczysz-czonego produktu. Wynika z tego, iż etapoczyszczania powoduje częściową denatu-rację białka. Zaobserwowano również, iżwykrywalność antygenu w teście opartymna Mabs wyniosła 0, 05 µg/ml białka VP73,a w ELISA z przeciwciałami poliklonalnymipoziom detekcji wynosił 0, 6 µg/ml VP73.Prowadzono również badania nad wyko-rzystaniem rekombinowanego białka wi-rusowego jako antygenu i dowiedziono, żewykazuje ono większą czułość w stosunkudo surowic w stanie rozkładu (7). Ponad-to eliminuje konieczność pracy z wirusemzakaźnym (16). Gallardo i wsp. (16), sto-sując białka rekombinowane P54, PK205R,PB602L i PA104R, uzyskali zgodność dlawiększości badanych próbek z technikamirekomendowanymi przez OIE, z użyciembiałek klasycznych. W  przypadku nega-tywnych próbek europejskich specyficz-ność dla białek PA104R i PK205R wyniosła99%, dla P54 97%, a dla PB602L 95%. Spe-cyficzność ELISA OIE była bardzo zbliżonai wyniosła 95%. W przypadku próbek eu-ropejskich dodatnich wyniki również byłyporównywalne (nieco niższą specyficz-ność zaobserwowano tylko w przypadkubiałka PA104R), co potwierdza, że białkaP54 i PB602L mogą znaleźć zastosowaniew serodiagnostyce ASF. Przeciwciała prze-ciwko białku P54 są stabilne nawet po dłu-giej inkubacji w 37°C. Wysoką specyficz-ność białek rekombinowanych i ELISA-OIEpotwierdzono także w odniesieniu do pró-bek pochodzących z zachodniej i wschod-niej Afryki, natomiast w przypadku próbekdodatnich z Ugandy i Mozambiku białkarekombinowane były mniej czułe. PonadtoŻycie Weterynaryjne • 2013 • 88(9)zaobserwowano, iż przeciwciała wobecP54 i PB602L pojawiły się po 10 dniach pozakażeniu w odniesieniu do szczepów po-chodzących z Ugandy i Hiszpanii. W przy-padku zakażenia hiszpańskim izolatemE75  CV14  miano przeciwciał utrzymy-wało się do 30 d.p.z. Hutchings i wsp. (17)oceniali dwa testy ELISA pośrednie, opar-ty na zastosowaniu Mab (4H3) i stosują-cy kombinację Mab z  surowicą poliko-nalną (przeciwciała królicze anty-świncemorskiej, królicze anty-mysie oraz kozieanty-królicze). Czułość testu opartego naprzeciwciałach świnki morskiej i  królikabyła najlepsza dla wirusa o mianie pomię-dzy 2,74 i 6,55 log10HAD50/ml, natomiastw przypadku połączenia Mab z przeciw-ciałem króliczym najlepszymi wartościa-mi okazały się 3,64 i 6,25 log10HAD50/ml.Przydatność obydwu testów w wykrywa-niu antygenów różnych szczepów wirusaafrykańskiego pomoru świń była bardzoduża, jednakże test stosujący przeciwcia-ła poliklonalne cechował się nieznaczniewiększą czułością.Techniką stosowaną do potwierdzeniapozytywnych wyników testu ELISA anty-genowa, w szczególności w przypadku wy-stąpienia ognisk pierwotnych afrykańskie-go pomoru świń, jest izolacja wirusa orazwykazanie hemadsorpcji – HAD. Z uwagina pracę z materiałem wysoce zakaźnymbadania te mogą być przeprowadzane w la-boratoriach spełniających wymagania okre-ślone w decyzji Komisji 2003/422/WE. Izo-lacja wirusa opiera się na zakażeniu homo-genizatem tkanek lub krwi, pochodzącymod świń podejrzanych o zakażenie, hodowlikomórkowej pierwotnej szpiku kostnego,leukocytów, monocytów lub makrofagów(14). Hemadsorpcja polega na tym, że ery-trocyty adsorbują do powierzchni komórekzakażonych wirusem afrykańskiego pomo-ru świń, tworząc charakterystyczne rozety.W przebiegu zjawiska hemadsorpcji dużeznaczenie mają dwa geny – ORF EP402Rodpowiada za adhezję krwinek czerwo-nych świni do zakażonych komórek, nato-miast ORF EP153R pełni funkcję stabiliza-tora erytrocytów. Po 48–49 godzinach re-plikujący w komórce wirus afrykańskiegopomoru świń wywołuje efekt cytopatyczny(cpe), objawiający się degradacją komórek(7). Wynik odczytuje się przy użyciu mi-kroskopu, odczyt mający na celu stwier-dzenie hemadsorpcji lub wystąpienie cpepowinien być przeprowadzany codzien-nie, pierwszą obserwację należy wykonaćjuż po upływie 14–16 godzin od zakażenia.W przypadku próbek silnie dodatnich he-madsorpcję można zauważyć już w ciągu24 godzin (14). Zastosowanie hemadsorpcjijest przydatne w przypadku ujemnego wy-niku innych testów diagnostycznych (10).Pozytywny wynik HAD jest traktowanyjako ostateczny w rozpoznawaniu nowychognisk afrykańskiego pomoru świń (14).Warto nadmienić, że hemadsorpcja jestcharakterystyczna dla większości szcze-pów wirusa afrykańskiego pomoru świń,ponadto wirus ten jako jedyny spośród wi-rusów atakujących świnie wywołuje to zja-wisko. Niekiedy można spotkać szczepyniehemadsorpcyjne o  niskiej zjadliwościlub wywołujące typową ostrą postać afry-kańskiego pomoru świń. Mimo możliwościwykrycia niskiego miana wirusa afrykań-skiego pomoru świń, hemadsorpcja posia-da pewne wady. Do wykonania testu nie-zbędna jest świeża hodowla komórkowa,której podtrzymywanie wiąże się z  wie-loma problemami (słaby wzrost, koszty).Niekiedy przyczynia się to do opóźnieniaotrzymania ostatecznego wyniku badania.W niektórych przypadkach zadeklarowa-nie wyniku ujemnego może nastąpić do-piero po 6 dniach (14, 17).Innym testem polegającym na wykry-waniu antygenów wirusa afrykańskiego po-moru świń jest DIF. Podobnie jak IPT, tech-nika ta wykazuje wysoką czułość w przy-padku ostrej postaci choroby, natomiastw przypadkach podostrych i przewlekłychobserwuje się spadek jej czułości nawet do40%. Test opiera się na wykrywaniu anty-genów wirusowych w skrawkach lub od-ciskach tkanek pochodzących od świń po-dejrzanych o zakażenie, za pośrednictwemkoniugatu antywirusowego sprzężonegoz barwnikiem fluorescencyjnym (najczę-ściej FITC). W  zakażonych komórkachfluoryzuje cytoplazma. Bezpośrednia im-munofluorescencja ma także zastosowa-nie w wykrywaniu niehemadsorpcyjnychszczepów wirusa afrykańskiego pomoruświń. Ponadto bardzo dobrze rozróżniaefekt cytopatyczny charakterystyczny dlatego wirusa (7, 14). Jednoczesne zastoso-wanie obydwu technik – DIF i IIF jest bar-dzo skuteczne, ponieważ w  czasie krót-szym niż 3 godziny umożliwia identyfika-cję 89%–95% przypadków afrykańskiegopomoru świń (10).Badania molekularneW ostatnich latach coraz większe zastoso-wanie znajdują techniki biologii moleku-larnej i inżynierii genetycznej, mające nacelu wykrycie DNA wirusa afrykańskiegopomoru świń (6, 14). Najpowszechniej wy-korzystywaną jest łańcuchowa reakcja po-limerazy (PCR). Ze względu na jej wysokączułość, łatwość i szybkość wykonania (wy-nik można uzyskać w ciągu 4 godzin), moż-liwe jest bardzo wczesne wykrycie wirusaw badanych próbkach, zanim pojawią sięobjawy chorobowe u zakażonych zwierząt(7). Ponadto umożliwia ona wykorzystanieróżnorodnego materiału biologicznego doizolacji DNA (18). Podobnie jak w przy-padku badań wirusologicznych, badania te747Prace poglądowemogą być przeprowadzane w laboratoriachspełniających wymagania określone w de-cyzji Komisji 2003/422/WE. W przypad-ku tkanek do badania pobiera się niewiel-ki wycinek, który następnie jest homoge-nizowany i wirowany. Tak przygotowanyhomogenizat stosuje się jako materiał doizolacji DNA (9). Izolacja DNA rozpoczynasię od inkubacji badanej próbki z proteina-zą K w obecności soli chaotropowych, codoprowadza do rozpadu komórek i uwol-nienia kwasu nukleinowego. Izolacja prze-prowadzana jest na kolumienkach zawie-rających włókna szklane, na których bar-dzo dobrze osadzają się kwasy nukleinowe,które są następnie oczyszczane w  kolej-nych etapach płukania i wirowania. Osta-tecznie DNA jest uwalniane z kolumienkidzięki elucji za pomocą jałowej wody lubodpowiedniego buforu. Wyizolowany DNAstanowi matrycę dla reakcji PCR, przepro-wadzanej w kilku etapach. W pierwszymetapie, w temperaturze 95°C, następuje roz-dzielenie podwójnej nici kwasu nukleino-wego. W kolejnym etapie, w niższej tempe-raturze, odbywa się przyłączenie krótkichodcinków DNA, tzw. starterów (prime-rów) komplementarnych, do odpowied-nich fragmentów matrycy. Temperatura,w  której przyłączają się startery w  przy-padku wirusa afrykańskiego pomoru świńwynosi najczęściej 62 i 58°C. Jest ona za-leżna od temperatury topnienia starterów,ściśle powiązanej z ich sekwencją nukle-otydową. W trzecim etapie (temp. 72°C),przy użyciu enzymu polimerazy, następu-je przyłączenie komplementarnych nukle-otydów (dNTPs), co rozpoczyna syntezędrugiej nici kwasu nukleinowego. Prze-prowadzenie PCR jest możliwe dzięki za-stosowaniu termocyklerów. W przypadkuwirusa afrykańskiego pomoru świń stosu-je się 40 cykli amplifikacji, celem powiele-nia fragmentu DNA do bardzo dużej ilościkopii, co pozwala na wizualizację produk-tu reakcji po zastosowaniu odpowiedniegobarwnika. W diagnostyce wirusa afrykań-skiego pomoru świń stosowane są dwa ro-dzaje testów: PCR konwencjonalny i PCRw  czasie rzeczywistym (real-time PCR).Konwencjonalny PCR dla wirusa afrykań-skiego pomoru świń opiera się na zastoso-waniu starterów komplementarnych dowysoce konserwatywnego regionu geno-mu VP72. W celu uwidocznienia produk-tu PCR konwencjonalnego przygotowu-je się żel agarozowy z dodatkiem bromkuetydyny wiążącego DNA. Do specjalnychstudzienek w żelu przenosi się mieszaninęreakcyjną powstałą podczas reakcji PCR,kontrolę dodatnią oraz wzorzec masy mo-lekularnej. Mieszanina reakcyjna zawieraodpowiedni barwnik, zwykle bromofenol.Po przeprowadzeniu elektroforezy, pro-dukty PCR oraz kontrola dodatnia, dziękidziałaniu promieni UV uwidaczniają sięna żelu w postaci pojedynczych prążków,natomiast wzorzec molekularny przyjmujepostać drabinki złożonej z wielu prążków.DNA próbki badanej jest porównywane dowzorca masy molekularnej, dzięki czemumożliwe jest oszacowanie jego wielkości.Próbkę DNA uznaje się za dodatnią, jeśliprążek na żelu będzie na tej samej wysoko-ści, co prążek kontroli pozytywnej. W kon-troli negatywnej nie obserwuje się obecno-ści prążków. Konwencjonalny PCR zaleca-ny przez OIE charakteryzuje się czułościąi specyficznością osiągającą blisko 100% (7).W celu potwierdzenia uzyskanych wy-ników można przeprowadzić trawienie am-plifikowanych produktów PCR za pomocąendonukleaz restrykcyjnych. Agüero i wsp.(19), używając 10-krotnych rozcieńczeńszczepu Spain 70 o mianie 1, 6 x 106 50% jed-nostek hemadsorpcji (HADU50/ml), określiligranice wykrywalności testu PCR opartegona VP73. Dzięki analizie sekwencji genomuograniczonej zestawem starterów PPA-1/2określili miejsca cięcia restrykcyjnej endo-nukleazy BsmAI oraz podział amplikonuna dwa fragmenty o długości 173 i 84 pz.Startery PPA-1/2 dawały 10-krotny wzrostczułości PCR, w porównaniu do zestawustarterów OIE, oraz pozwoliły na wykry-cie genomu ASFV o 1 dzień wcześniej (już2 d.p.z.). Startery te zastosowano równieżdo analizy zdegradowanych próbek oraz wy-cinków nerki świń eksperymentalnie zaka-żonych szczepem Lizbon 60 i przechowy-wanych w temperaturze pokojowej przez14 i 28 dni. Oba zestawy starterów okaza-ły się przydatne, jednak PPA-1/2 wykazaływyższą czułość – 0, 12 HADU50, w porów-naniu do testu zalecanego przez OIE orazbardzo dużą przydatność do wykrywaniaświatowych izolatów wirusa afrykańskie-go pomoru świń. Metoda ta jest znormali-zowana i może być zastosowana dla próbekkrwi, surowicy oraz dla słabo zachowanychtkanek. Ponadto jest bardzo specyficzna,gdyż nie wykazuje fałszywie dodatnich re-akcji, a czas osiągnięcia ostatecznego wy-niku jest krótszy niż 5 godzin.Ze względu na manipulację amplifikowa-nych fragmentów, a tym samym większe ry-zyko zakażenia, konwencjonalny PCR corazczęściej zastępowany jest przez inne techni-ki. Jedną z nich jest real-time PCR. Mimo iżjej opracowywanie jest pracochłonne i kosz-towne, posiada ona wiele zalet, w porów-naniu do konwencjonalnego PCR (20). Jesttechniką bardziej zautomatyzowaną, czułą,szybką oraz pozwala na jednoczesny, ilościo-wy odczyt wyników i wyeliminowanie reak-cji krzyżowych (14, 21). Real-time składa sięz analogicznych etapów, jak konwencjonal-ny PCR, z pominięciem etapu elektroforezy,dzięki czemu eliminuje się szkodliwe dzia-łanie bromku etydyny, natomiast w badaniuwykorzystuje się dodatkowy reagent – son-dę specyficzną dla wysoce konserwatywnegoregionu VP72 ASFV, np. typu TaqMan orazfluorochromy. Pozwala to na ciągłą obser-wację dynamiki powielania fragmentu DNAna podstawie krzywej określającej intensyw-ność sygnału fluorescencji. W badaniu wy-znacza się tzw. treshold cyklu (Ct) – jest towartość, w której fluorescencja osiąga wy-krywalny poziom, a jej sygnał przewyższasygnał tła. Treshold wykazuje wartości od-wrotnie proporcjonalne do ilości amplifiko-wanego fragmentu DNA. Jeżeli wartość Ctbędzie poniżej 38, a wykres wystąpi w po-staci krzywej sigmoidalnej, próbkę uznajemyza pozytywną. Przy wartościach Ct w prze-dziale 38–40 i w przypadku pojawienia sięwykresu sigmoidalnego próbki traktujemyjako wątpliwe, przy braku Ct lub liniowymkształcie wykresu uznajemy je za ujem-ne. Pierwszy real-time PCR do wykrywa-nia ASFV, oparty na białku VP72 i sondzieTaqMan wyznakowanej barwnikami fluore-scencyjnymi (na końcu 3’ 6-carboxy-fluore-sceine (FAM), a na końcu 5’ 6-carboxy-tetra-methyl-rhodamine (TAMRA) został opra-cowany przez King i wsp. (22). Test wykazałczułość analityczną na poziomie pomię-dzy 10 a 100 kopii (14). Kolejny test opar-ty na białku strukturalnym VP72, opisanyprzez Zsak i wsp. (23), podobnie jak w pra-cy King i wsp. (22) opierał się na użyciu son-dy TaqMan, jednakże na końcu 3’ znajdowałsię wygaszacz minor grove binder nonflu-orescent quencher. Czułość testu opartegona badaniu DNA wyizolowanego z zainfe-kowanych makrofagów oraz z próbek krwiod świń zakażonych szczepem Pr4 wyno-siła od 1000 do 10000 HAD50/ml. W teścietym wszystkie spośród 48 badanych szcze-pów uznano za dodatnie, natomiast czu-łość analityczna kształtowała się na pozio-mie od 1, 4 do 8, 4. Podczas badania dużejliczby próbek klinicznych test charaktery-zował się wysoką specyficznością (100%),a jego czułość dla zeskrobin z migdałkówi wymazów z nosa, zwłaszcza w przypad-ku niskiego miana wirusa, wyniosła odpo-wiednio 95,4% i 92,8%. Mniejszą czułośćtestu, na poziomie 89,7%, zaobserwowanow przypadku próbek krwi. McKillen i wsp.(24) zaprojektowali test z zastosowaniemsondy minor groove binder, wyznakowa-nej na końcu 3’ FAM, a na końcu 5’ wyga-szaczem (Eclipse Dark Quencher), skon-struowanej zgodnie z sekwencją genu 9GLwirusa afrykańskiego pomoru świń. Sondaposiadała trójwymiarową konformację, dzię-ki temu pozwalała na bliskie położenie wy-gaszacza i fluoroforu. Podczas przeprowa-dzania optymalizacji testu dowiedziono, iżwykazuje on bardzo dobrą liniowość i zdol-ność wykrywania od 2×101 do 2×1010 kopiiDNA/µl. Test oparty na sondzie minor gro-ove binder wykazał większą czułość w po-równaniu do testu TaqMan PCR, wynoszą-cą odpowiednio 40 i 20% dla materiału ge-netycznego rozcieńczonego 10-5. NatomiastŻycie Weterynaryjne • 2013 • 88(9)748Prace poglądoweporównywany konwencjonalny PCR wyka-zał 20% możliwość wykrycia powielonegomateriału w rozcieńczeniu 10-4 oraz 100%w 10-3. Do opracowania tego testu wyko-rzystano szczep Spain 75 wirusa afrykań-skiego pomoru świń, natomiast jego oce-nę przeprowadzano w oparciu o 14 innychszczepów wirusa należących do genotypu I,V, VIII i IX. Czułość analityczna testu wy-niosła 20 kopii.Tignon i wsp. (25) wykazali ulepszonączułość diagnostyczną i  analityczną te-stu dla białka VP72 opartego na kontroliwewnętrznej B-aktyny, która wyniosła 5,7–57 kopii. Test opierał się na zastosowa-niu sondy TaqMan wyznakowanej barw-nikami FAM i  TAMRA. W  odniesieniudo konwencjonalnego testu PCR Agüeroi wsp. (19) specyficzność tej techniki wy-niosła 96%, a czułość 85%, natomiast w po-równaniu do real-time PCR wg. King i wsp.(22) specyficzność i czułość osiągnęły od-powiednio 99 i 82%. Opisany test Real-TimePCR wykazywał zdolność do wcześniejsze-go wykrywania infekcji (już w 3–7 d.p.z.).Najnowsza technika opracowana przezFernández-Pinero i wsp. (20), wykorzysty-wana aktualnie w Krajowym LaboratoriumReferencyjnym ds. ASF, opiera się na am-plifikacji fragmentu DNA wewnątrz regio-nu kodującego VP72. Stosuje ona specjal-nie zaprojektowany zestaw starterów orazzbiór 165 sond o długości 8–9 kwasów nu-kleinowych, wyznakowanych dwoma barw-nikami, FAM na końcu 5’ i dark quencher nakońcu 3’ – Universal Probe Library (UPL).Kontrola wewnętrzna testu opiera się na de-tekcji fragmentu genu endogennej B-akty-ny. Do zalet sond UPL należy łatwość wyko-nania badania oraz dość niskie koszty. PCRz zastosowaniem UPL, w porównaniu z te-stem referencyjnym OIE z sondą TaqManopracowanym przez King i wsp. (22), po-siadał 10-krotnie lepszą czułość analitycz-ną w odniesieniu do szczepów ASFV na-leżących do genotypu I występującego naSardynii i Afryce Zachodniej, VIII (genotypo największej rozbieżności) i IX występu-jącego w Afryce Wschodniej. Granica wy-krywalności PCR stosującego UPL wynio-sła 14–18 kopii. Identyfikacja wirusowegoDNA w niektórych próbkach pochodzącychod zwierząt zakażonych szczepami ASFVo różnej wirulencji (należących do genoty-pu I, II, IX i X) możliwa była o tydzień wcze-śniej niż z sondą TaqMan. W przypadku bra-ku typowych objawów klinicznych i obec-ności przeciwciał test oparty na sondzieUPL umożliwiał wykrycie zakażenia. Czu-łość diagnostyczna testu stosującego son-dę UPL była wyższa, co potwierdzono wy-kryciem ponad 10% więcej próbek pozytyw-nych w porównaniu z metodą referencyjną.Ze względu na podobieństwo objawówklinicznych afrykańskiego pomoru świńi klasycznego pomoru świń (CSF) zalecaneŻycie Weterynaryjne • 2013 • 88(9)jest zastosowanie technik umożliwiającychjednoznaczne rozróżnienie tych jednostekchorobowych (26). Do tego celu używanyjest między innymi konwencjonalny multi-plex PCR opracowany przez Agüero i wsp.(27) oparty na dwóch zestawach specyficz-nych starterów, odpowiednich dla każde-go z patogenów. Wykrywanie produktówreakcji polega na porównaniu amplifiko-wanych fragmentów o  różnej długości.Test umożliwiał wczesne wykrycie wiru-sów – już od 3 DPZ. Multiplex PCR wy-kazał 10-krotnie niższą czułość niż poje-dynczy (simplex) PCR Agüero i wsp. (19).W  teście hot start multiplex PCR,opracowanym przez Giammarioli i  wsp.(26), mającym na celu odróżnienie ASFVi CSFV, zaobserwowano o 2 log mniejszączułość, w  porównaniu z  konwencjonal-nym simplex PCR opracowanym przezAgüero i wsp. (19) i o 1 log mniejszą niżwspomniany powyżej multiplex PCR wgAgüero i wsp. (27). Optymalizacja multi-plex PCR wymaga doboru odpowiednichwarunków reakcji, przede wszystkim stężeńreagentów i temperatury przyłączania star-terów. Zastosowanie różnorodnych starte-rów w tej samej probówce reakcyjnej możewywołać negatywne skutki, ze względu naich wzajemne oddziaływanie i blokowaniereakcji. Poważne konsekwencje w zakresieczułości testu może wywołać zmiana zale-dwie kilku par zasad startera. W reakcjachmultiplex PCR, w których sprawdzane sązarówno DNA (ASFV), jak i RNA (CSFV),odwrotna transkrypcja powinna być prze-prowadzona w niskiej temperaturze. Bar-dzo istotne jest zatem zastosowanie hotstart Taq polimerazy, ponieważ pozwalato uniknąć niespecyficznych amplifikacjispowodowanych przez przyłączanie sięstartera w niskich temperaturach (26, 27).W  przypadku braku specjalistyczne-go sprzętu do amplifikacji materiału ge-netycznego możliwe jest zastosowanie te-stów izotermicznych, które przeprowadza-ne są w jednej temperaturze (14). Odczytwyników odbywa się za pomocą prostegofluorescencyjnego czytnika płytek. Pierw-szy izotermiczny test opracowany dla ASFprzez Hjertner i wsp. (28) nie wykazywał re-akcji krzyżowej z RNA wirusa afrykańskie-go pomoru świń. Czułość testu wynosząca2500 kopii była wystarczająca do wykryciaDNA w próbkach, w których stężenie wi-rusa było wysokie, jednakże była niższa niżw przypadku innych testów molekularnych.W szybkim wykryciu niewielkich ilości wi-rusa przydatność wykazał test LAMP (29).Różnice między izolatami wirusa afry-kańskiego pomoru świń można wykazaćrównież za pomocą sekwencjonowania(14). Boshoff i  wsp. (30), analizując cen-tralny region zmienności (CVR) charakte-ryzujący9RLORF (kodujący jedno z naj-ważniejszych białek strukturalnych ASFV– VP72), wyróżnili występowanie 22 głów-nych genotypów wirusa afrykańskiego po-moru świń na kontynencie afrykańskim.Inną metodą diagnostyczną wykorzystu-jącą materiał genetyczny jest hybrydyzacja,jednakże jej wykorzystanie w  rutynowejdiagnostyce laboratoryjnej afrykańskiegopomoru świń jest ograniczone ze względuna kosztowność i pracochłonność metody.Oura i wsp. (31) dzięki zastosowaniu son-dy DIG zaobserwowali występowanie wi-rusa afrykańskiego pomoru świń w mono-cytach-makrofagach, komórkach nabłon-ka, neutrofilach i hepatocytach. Ponadtoudowodnili wewnątrzjądrową lokalizacjęwirusa afrykańskiego pomoru świń w za-każonych komórkach, co mogło być efek-tem wczesnego zakażenia. Badania Carra-sco przeprowadzone w 1996 r. wykazały, iżwewnątrzjądrowe barwienie limfocytówT świadczy o  ich podatności na zakaże-nie w późniejszych stadiach choroby (32).PodsumowaniePojawienie się ognisk afrykańskiego pomo-ru świń w niedalekiej odległości od wschod-niej granicy Polski, a tym samym zwiększo-ne ryzyko przeniesienia wirusa afrykańskie-go pomoru świń do kraju i wynikające z tegopoważne konsekwencje ekonomiczne, wy-muszają gotowość diagnostyczną. Jak wy-nika z przedstawionych powyżej informa-cji, aktualnie dysponujemy różnorodnymiklasycznymi i nowoczesnymi technikamiumożliwiającymi bezpośrednią lub pośred-nią identyfikację wirusa afrykańskiego po-moru świń. Wiele z nich jest wykorzystywa-nych w Krajowym Laboratorium Referencyj-nym ds. ASF. Wybór metody zależy przedewszystkim od aktualnej sytuacji epidemiolo-gicznej kraju, możliwości zapewnienia przezlaboratorium pracy zgodnej z zasadami bio-bezpieczeństwa oraz kosztów. W okresie za-grożenia wprowadzenia wirusa afrykańskie-go pomoru świń do kraju wolnego od cho-roby, z uwagi na obecność wirusa we krwijuż od 2 dnia po zakażeniu aż do śmiercizwierzęcia, każda próbka surowicy powin-na być traktowana jak materiał potencjal-nie wysoce zakaźny i powinna być równo-legle badana w kierunku obecności wirusaoraz swoistych przeciwciał. Podejmując de-cyzje dotyczące laboratoryjnego rozpozna-wania choroby, trzeba mieć świadomość, żeniewłaściwie zorganizowany system badańmoże sprzyjać rozprzestrzenianiu się wirusawraz z materiałem diagnostycznym.Piśmiennictwo1. Markowska-Daniel I.: Aktualne dane na temat sytuacjiepizootycznej w  zakresie afrykańskiego pomoru świń.Życie Wet.2008,83,982-990.2. Markowska-Daniel I.: Sytuacja epizootyczna afrykańskie-go pomoru świń w latach 2007-2010.Życie Wet.2010,85,736-742.749

zanotowane.pl

doc.pisz.pl

pdf.pisz.pl

kachorra.htw.pl