19 X 2009
WYKŁAD 3
by pupazzo
Panie i Panowie, zaczynamy kolejny dział, mianowicie enzymologia.
ENZYMOLOGIA KLINICZNA
Lekarza praktyka interesują enzymy w 2 aspektach. Po pierwsze, w aspekcie diagnostycznym, tym zajmuje się dział biochemii zwany enzymologią kliniczną. A drugi aspekt, który lekarza interesuje, to wpływ różnych czynników na aktywność enzymu, czyli przede wszystkim wpływ toksyn, które mogą zahamować aktywność enzymu w różnym mechanizmie lub cała plejada leków, których działanie na enzymy to jest bądź to aktywacja – rzadziej, bądź inhibicja – częściej. Na zajęciach seminaryjnych będą te zagadnienia szczegółowiej omawiane. Ja chcę Państwu jedynie dzisiaj jakąś ideę wykorzystania enzymów w diagnostyce laboratoryjnej, w diagnostyce medycznej dzisiaj przedstawić.
Badania, które należą do enzymologii klinicznej należą do bardzo częstych badań laboratoryjnych wykonywanych u człowieka, w diagnostyce chorób, w monitorowaniu. Praktycznie nie ma specjalizacji lekarskiej, która by w oparciu o enzymologię nie kształtowała swojego wizerunku na temat stanu zdrowia i choroby. Oczywiście idea jest taka, żeby przy pomocy badania laboratoryjnego w sposób czuły i swoisty rozpoznać chorobę, czyli ideałem byłoby, aby enzym był charakterystyczny bądź to dla narządu, bądź to dla stanu chorobowego. I w większości sytuacji tak jest. Ale tak jak to w życiu, życie przerosło kabaret, a postęp nauk podstawowych wyprzedził aplikację kliniczną. I wbrew temu, czego będziecie się Państwo uczyć, na dzień dzisiejszy, praktycznie w bardzo niewielu enzymach możliwe jest oznaczenie aktywności poszczególnych form, charakterystycznych dla narządu lub dla choroby. Ale ponieważ to się może zmienić, musimy mówić o ideach, które z czasem może się wprowadzą w czyn. Żeby można było diagnozować choroby lub mówić o funkcji narządów, konieczne jest rozróżnienie różnych form enzymów, czyli musimy zacząć od rozmowy o różnych formach enzymów, czyli ich heterogenności.
Heterogenność enzymów
Przyczyny:
Ø uwarunkowana genetycznie (izoenzymy)
Ø enzymy modyfikowane posttranslacyjnie
To, co wykorzystujemy w diagnostyce laboratoryjnej, to są formy, różne formy danego enzymu uwarunkowane genetycznie. I takie formy uwarunkowane genetycznie nazywamy izoenzymami.
Drugą przyczyną heterogenności, której to nie wykorzystujemy w diagnostyce laboratoryjnej, to jest heterogenność uwarunkowana modyfikacjami posttranslacyjnymi białek. I to nie są izoenzymy, mimo, że pod wieloma właściwościami od enzymu innego, zasadniczego, się różnią. Zaraz do tego dojdziemy.
NIE-IZOENZYMY
Ø fosforylacja
Ø mostki disiarczkowe
Ø α-amylazy
Zacznijmy od tych, które są nie-izoenzymami. No co my tu mamy.
Dobrze nam już znane modyfikacje o typie fosforylacji i defosforylacji. Czyli odpowiednio fosforylaza glikogenu, w formie ufosforylowanej i defosforylowanej – to nie są izoenzymy. To są formy tego samego enzymu zmodyfikowane posttranslacyjnie.
Inny przykład. Powstawanie lub usuwanie mostków disiarczkowych. Również taki enzym przed i po modyfikacji to nie są izoenzymy, nie są izoformy tego samego enzymu. Te 2 modyfikacje są bardzo charakterystyczne i istotne w przypadku jednego enzymu, mianowicie α-amylazy. α-amylaza, która posiada szereg izoenzymów obecnych w osoczu krwi, szczegóły w skrypcie i w podręcznikach, to nie jest przedmiot teraz naszych rozważań, może również wchodzić w modyfikacje nieizoenzymatyczne, np. może łączyć się z innymi białkami. Takim białkem może być komponent M, czyli γ-globulina monoklonalna występująca w niektórych chorobach układu hemopoetycznego – szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenströma. No i taka przyłączona do innego białka α-amylaza dalej pozostaje α-amylazą, nie jest to izoenzym.
Kolejna modyfikacja dotycząca tego samego enzymu, mianowicie α-amylazy, tworzenie się agregatów, czyli jest to zaburzenie uwarunkowane genetycznie. Cząsteczki α-amylazy agregują ze sobą; tu łączyły się z innym białkiem w poprzedniej modyfikacji, a tu łączą się ze sobą. α-amylaza jest enzymem drobnocząsteczkowym, jako unikalną właściwością w sensie diagnostycznym jest fakt, że α-amylaza filtruje się w kłębkach nerkowych, można jej aktywność oznaczyć w zbiórce moczu, dobowej, godzinowej, sześciogodzinnej, dwunastogodzinnej. W przypadku wszelkich substancji drobnocząsteczkowych większą przydatność diagnostyczną ma oznaczenie zawartości takiej substancji w dobowej zbiórce moczu niż w jednorazowej porcji krwi. Bo skoro bez przeszkód się filtruje, to jej zmiany stężenia w surowicy krwi lub aktywności nie odzwierciedlają stanu patologicznego.
Jaką mamy charakterystyczną zmianę w przypadku tych dwóch modyfikacji? W przypadku połączenia się z innym białkiem lub w przypadku asocjacji ze sobą powstają takie konglomeraty tegoż białka enzymatycznego, które uniemożliwiają filtrację kłębkową i w rzeczywistości mamy sytuację taką: podwyższoną lub prawidłową aktywność w surowicy krwi przy nieobecności aktywności w moczu. Te dwa zjawiska, czyli tworzenie się agregatów ze sobą, lub tworzenie się agregatów z innymi białkami nosi nazwę makroamylazemii. Makroamylazemia. A wymiarem laboratoryjnym tych zaburzeń jest to, że w moczu, jak powiedziałem, aktywność α-amylazy równa się zero, przy prawidłowej lub podwyższonej aktywności w surowicy krwi.
Kolejny przykład czegoś, co nie jest izoenzymem. Proszę, tu mamy modyfikację posttranslacyjną, o typie ograniczonej proteolizy. Czyli tak np. pepsynogen przekształca się w pepsynę. Trypsynogen w trypsynę. Trypsynogen nie jest izoenzymem trypsyny, tak jak pepsyna nie jest izoenzymem pepsynogenu, to są modyfikacje posttranslacyjne.
Warunkiem uznania za izoenzym, jest uwarunkowanie tej modyfikacji, tej odmiany, genetycznie.
IZOENZYMY
Pochodzenie:
· multi loci kodujące białka enzymatyczne
na 1 chromosomie
na wielu chromosomach
· formy alleliczne genu kodującego białko enzymatyczne (alleloenzymy)
· heterogenność składu podjednostkowego (enzymy hybrydowe)
Skąd izoenzymy pochodzą? No mogą być to multi loci kodujące dane białka enzymatyczne zlokalizowane na jednym chromosomie, albo na wielu chromosomach, zaraz takie przykłady będziemy pokazywać.
Mogą to być odmiany alleliczne, tak zwane alleloenzymy.
I wreszcie przykład, z którym będziecie Państwo mieli bardzo wiele do czynienia, występowanie tzw. enzymów hybrydowych. Enzym charakteryzuje się tym, że zbudowany jest z wielu podjednostek, czyli jest to białko mające strukturę czwartorzędową i przez różną kompozycję podjednostek powstają izoenzymy, no taki klasyczny przykład – dehydrogenaza mleczanowa, jeden z częściej używanych enzymów w diagnostyce laboratoryjnej, LDH, czy enzym, o którym będziemy dzisiaj mówić, CPK, czyli kinaza kreatynowa. I tutaj właśnie taki przykład. W zależności proszę Państwa od tego, z ilu podjednostek jest zbudowany enzym, ten przykład bardzo dobrze pasuje do koncepcji dehydrogenzay mleczanowej, bo ten enzym jest tetrametrem, zbudowanym z 2 typów podjednostek, podjednostki H i podjednostki M. Możemy mieć do czynienia albo z jednorodnymi podjednostkami, czyli będzie homotetramer, podobnie jak tu, możemy mieć formy składające się z różnych podjednostek, czyli heterotetramery. Jeśli enzym zbudowany jest z 2 podjednostek, to, jak łatwo zobaczyć, liczba kombinacji tych podjednostek jest znacznie mniejsza.
IZOENZYMY
Zmiana profilu:
Ø zależna od rozwoju
Ø zależna od choroby
Ideałem, czy założeniem w diagnostyce jest to, aby znaleźć związek między aktywnością izoenzymu, lub, może należałoby powiedzieć, stężeniem izoenzymu, bo w takim kierunku to dzisiaj ewoluuje, a po pierwsze – fazą rozwoju, i dwa – chorobą.
Co to znaczy faza rozwoju? Żeby analizować aktywność danego enzymu warto się zainteresować, jak w przebiegu rozwoju ontogenetycznego aktywność enzymu się zmienia. Za chwilę pokażę to na przykładzie fosfatazy alkalicznej.
Dalej – warto zdać sobie sprawę, jak aktywność tego enzymu zmienia się w szczególnych okolicznościach życia człowieka, np. w ciąży.
No a kolejny aspekt zagadnienia to taki, należy sobie zadać pytanie, czy następują takie zmiany w aktywności enzymu w przebiegu patologii, które sprawiają, że enzym ma przydatność diagnostyczną, czy istnieje coś, co się nazywa wartością predykcyjną. Wartość predykcyjna – pod tym pojęciem rozumie się: jeśli objaw, to choroba. To znaczy, muszą istnieć takie wartości aktywności enzymu, które z dużym prawdopodobieństwem przy zaplanowanej czułości i swoistości mogą nam odróżnić populację zdrowych od chorych. I w takim sensie służy do rozpoznawania chorób, jest markerem diagnostycznym.
Kolejna sprawa. Musimy wiedzieć, w jakiej fazie choroby aktywność enzymu pojawia się w surowicy krwi i dwa, jak wygląda ewolucja zmian aktywności. Na konkretnych przykładach będę to Państwu omawiał.
No i wreszcie trzeba sobie zdać sprawę, że są enzymy, które są przydatne do rozpoznania choroby, ale do monitorowania tej choroby absolutnie się nie nadają. Po prostu nie potem już żadnej korelacji między procesem zdrowienia a powrotem aktywności niektórych enzymów do wartości prawidłowych.
PROFIL ENZYMATYCZNY
fosfataza alkaliczna
Zależność od fazy rozwoju. Enzym fosfataza alkaliczna. Fosfataza alkaliczna, obecna w surowicy krwi, składa się z kilku frakcji izoenzymatycznych, ale tak naprawdę znaczenie mają dwie.
U osoby dorosłej za aktywność fosfatazy alkalicznej obecnej w surowicy krwi w 80% odpowiada izoenzym wątrobowo-żółciowy. Natomiast 20% aktywności fosfatazy alkalicznej przypada na izoenzym kostny. Z tego wynika, że u osoby dorosłej w diagnostyce pewnej grupy chorób wątroby, jakie, to do tego dojdziemy, fosfataza alkaliczna jest bardzo wartościowym enzymem. Ale obserwacji tej nie możemy przenieść na dziecko, gdybyśmy chcieli diagnozować chorobę wątroby u dziecka stosując oznaczanie aktywności fosfatazy alkalicznej, to czeka nas ogromne rozczarowanie, a właściwie postawienie nieprawidłowego rozpoznania. Ponieważ u dziecka, no powiedzmy do 12-13 roku życia, aktywność fosfatazy alkalicznej pochodzenia kostnego znacznie przewyższa aktywność fosfatazy alkalicznej pochodzenia wątrobowego. I jest to fizjologia. Fosfataza alkaliczna pochodzenia kostnego jest enzymem wydzielanym przez osteoblasty, i w okresie tworzenia kośćca wysoka aktywność tego enzymu, który uwalnia się w sposób bierny z kości, przenika do krwioobiegu, fałszuje to rozpoznanie. Większość laboratoriów oznacza aktywność całkowitą, czyli to, co tu mamy – mieszaninę różnych frakcji. Jak ominąć tą niedogodność? Należałoby oznaczać aktywność izoenzymu, albo aktywność izoenzymu wątrobowego w przypadku diagnostyki chorób wątroby, albo aktywność izoenzymu kostnego w przypadku diagnostyki chorób kości. W przypadku tego enzymu jest to stosunkowo łatwe do wykonania. Natomiast oznaczając całkowitą aktywność u dziecka należy liczyć się z tym, że wynik znacznie odbiega od wartości referencyjnych dla osoby dorosłej, co wynika z tego slajdu.
Kolejny przykład na podstawie tego samego enzymu. Jak powiedziałem, loci kodujące białko, w tym przypadku to białko enzymatyczne, mogą być zlokalizowane na różnych chromosomach. I tak jest w przypadku również fosfatazy alkalicznej. Mianowicie na chromosomie 1 mamy tzw. enzymy tkankowo niespecyficzne, wśród których znajdujemy szereg enzymów, które stosujemy w diagnostyce, ale nie o tym chcę tutaj mówić. Mianowicie na chromosomie 2 znajdują się loci, które kodują izoenzymy fosfatazy alkalicznej, które, wydawałoby się lat temu kilkadziesiąt, że zrewolucjonizują diagnostykę laboratoryjną. Mianowicie mamy tutaj tzw. izoenzymy nowotworowe, ich nazwy są tutaj podane: izoenzym Regana, izoenzym Nagao i izoenzym Kasahara. Pierwsze badania, to jest koniec lat 30. XX wieku, kiedy Fishman diagnozując pacjentów z rakiem płuca wykazał, że mają oni podwyższoną aktywność fosfatazy alkalicznej, co ciekawe, o właściwościach jako żywo przypominającej fosfatazę pochodzenia łożyskowego. A byli to mężczyźni, i nie w ciąży! Powstała więc koncepcja, że w sytuacjach nowotworzenia następuje swoisty molekularny switching i tkanka nowotworowa zaczyna produkować izoenzymy, które normalnie w tkance prawidłowej nie występują. Początkowo uznano te izoenzymy jako tzw. markery nowotworów, kolejne lata badań, diagnostyki, wykazały, że ich przydatność diagnostyczna na dzień dzisiejszy, jest, powiedzmy, zerowa. To znaczy, mając kogoś z wysoką aktywnością fosfatazy alkalicznej, która ponadto zachowuje się jak fosfataza alkaliczna pochodzenia łożyskowego, a cechą charakterystyczną tego izoenzymu jest to, że jest termostabilny, czyli ulega bardzo trudno inaktywacji termicznej, no należy mocno rozmyślać, czy gdzieś jednak proces nowotworzenia nie zachodzi. Natomiast nie jest to marker w takim sensie, że jak u kogoś oznaczymy aktywność tego enzymu, jest ona wysoka, to z dużym prawdopodobieństwem możemy rozpoznawać chorobę nowotworową. Takich substancji w diagnostyce biochemicznej, jak dotąd, jest bardzo, bardzo niewiele.
IZOENZYMY
Zróżnicowanie właściwości
Ø ruchliwość elektroforetyczna
Ø rozpuszczalność
Ø oporność na inaktywację fizykochemiczną
Ø wrażliwość na inhibitory
Ø aktywność molekularna
Ø stała Michaelisa
Ø zdolność do katalizy reakcji z udziałem analogów substratów
Ø antygenowość
No wskutek różnic w budowie izoenzymy różnią się również swoimi właściwościami rozmaitymi, co znalazło zastosowanie w diagnostyce laboratoryjnej, no przede wszystkim różnią się ruchliwością elektroforetyczną. No z tego wynika prosty wniosek, że bardzo prostą techniką diagnostyczną, jaką jest elektroforeza, możemy poszczególne izoformy odróżnić. No, częstokroć, ponieważ zmiany w strukturze izoenzymów są niewielkie i wpływają one w bardzo niewielkim stopniu na ruchliwość elektroforetyczną, trzeba uciekać się do pewnych kruczków, do pewnych haczyków, żeby te izoformy odróżnić, nie jest to metoda, powiedzmy sobie najlepsza, w takiej diagnostyce pod strzechami.
Druga właściwość, zmiana rozpuszczalności. To praktycznie ma zastosowanie w jednej technice, mianowicie w tzw. próbie riwanolowej, stosowanej w odróżnieniu izoenzymów aminotransferaz.
Kolejna cecha, różnice w oporności na właściwości fizykochemiczne. To jest najczęściej używana metoda, tą metodą możemy m.in. odróżnić fosfatazę alkaliczną pochodzenia wątrobowego, czyli ten izoenzym wątrobowo-żółciowy od izoenzymu kostnego. Wykonuje się tzw. test cieplny, w temperaturze 56 ° poprzez 5 minut następuje inaktywacja praktycznie całkowita izoenzymu pochodzenia kostnego, a w próbce zostaje nie zahamowany tylko i wyłącznie izoenzym wątrobowo-żółciowy. Test cieplny. Jest to metoda szeroko stosowana.
Wrażliwość na inhibitory specyficzne. No przykład fosfataza kwaśna izoenzym sterczowy. Wrażliwość na L-winian, na kwas winowy. Podobnie alkohol etylowy.
No i inne właściwości, to aktywność molekularna, inna stała Michaelisa, rzadziej stosowane metody diagnostyczne, z wykorzystaniem swoistych substratów, natomiast właściwość, która stanowi pewien przełom w diagnostyce laboratoryjnej, to zmiana antygenowości.
Enzym, jak każde białko, cechuje się dwoma cechami: immunogennością i antygenowością. Immunogenność to zdolność do wytworzenia przeciwciał przeciwko temu białku, jeśli zaszczepimy odpowiednie zwierzę doświadczalne. W surowicy krwi tego zwierzęcia pojawią się przeciwciała przeciwko białku, którym zaszczepiliśmy je, czyli przeciwciała przeciwko konkretnemu izoenzymowi. A antygenowość to zdolność tego białka, tego naszego enzymu, do przereagowania z tymi ciałami, czyli do powstania kompleksu immunologicznego, który to metodami, dziś już stosowanymi powszechnie w diagnostyce laboratoryjnej, możemy wykorzystać do oceny, no właśnie – czego? Stężenia tego białka. No i tu się świat, proszę Państwa, wali. W przypadku enzymów zawsze miarą ich ilości była ocena ich aktywności, czyli poznawaliśmy je po czynach, po ubytku substratu lub na podstawie przyrostu produktu. Tym samym stosując te metody, metody immunologiczne oceny białek, z którymi na ćwiczeniach się Państwo spotkacie, oceniamy nie aktywność enzymu, tylko jego ilość. Jak to poznać? No jeśli wartości wyniku będziemy mieli podane w jednostkach międzynarodowych, w katalach, czy podwielokrotnościach katali, to wiemy, że został oceniony enzym ze względu na swoją aktywność, czyli to, co on zrobił, typową metodą kinetyczną. ...