sekwencjonowania DNA c.d
Czy można odczytać sekwencje odcinka DNA długości
kilkuset kpz w jednej reakcji enzymatycznej?
1. Sekwencjonowie poprzez podklowanie fragmentów
restrykcyjnych do wektorów np. plazmidowych
2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem wędrówki starterów (
primer
walking
)
Zalety
i wady strategii hierarchicznej
chromosom
kontigi klonów
biblioteki
uzyskane
sekwencje
Zalety
1. Łatwość wypełniania przerw w ciągłej sekwencji
2. Łatwiejsze składanie uzyskanych sekwencji szczególnie w przypadku
złożonych genomów bogatych w sekwencje powtórzone
Wady
1. Konieczność konstrukcji i układania klonów biblioteki
2. Czasochłonność
Strategia przypadkowej fragmentacji genomu „shotgun”
1. nie wymaga tworzenia i kontigów klonów
Metoda szybsza ,
uznawana
(niesłusznie!!!) za przydatną do sekwencjonowania
jedynie małych genomów
Izolacja DNA
Przypadkowa fragmentacja genomu
(trawienie lub
sonikacja
)
Elektroforeza w żelu agarozowym i
izolacja fragmentów DNA określonej
wielkości (zwykle małe do 10 kpz,
najczęściej jeszcze mniejsze
1.6-2.0
kpz
Klonowanie w uniwersalne wektory
(pUC) niekoniecznie
(
nieobligatoryjne w metodach
sekwencjonowania NGS
)