klonowanie molekularne DNA
KLONOWANIE GENÓW
Termin „klonowanie” w odniesieniu do pojedynczego
fragmentu DNA oznacza
namnożenie
określonego odcinka
DNA w komórkach gospodarza,
najczęściej bakterie
np.
Escherichia coli, przy zastosowaniu odpowiedniego wektora.
Klonowanie DNA jest podstawową techniką biologii molekularnej. Stosuje
się ją w celu:
•
znalezienia i wyizolowania wybranego genu z genomu jakiegoś
organizmu,
•
namnożenia badanego fragmentu DNA,
•
przeprowadzania manipulacji, na przykład mutagenezy,
•
uzyskiwania ekspresji genu, czyli produkcji kodowanego przez niego
produktu.
Aby skutecznie manipulować genami niezbędne są odpowiednie
narzędzia, z których najważniejsze to enzymy restrykcyjne,
ligazy oraz
wektory
.
•
Klonowanie molekularne można przeprowadzić w komórkach
mikroorganizmów jak i eukariotycznych, ale
•
Klonowanie w komórkach prokariotycznych jest
nieporównywalnie prostsze
ponieważ bakteryjne klony komórek, łatwo jest hodować i
izolować z nich duże ilości specyficznego DNA, które można
poddawać licznym procesom: sekwencjonowaniu,
mapowaniu, transformacji, hybrydyzacji itd.
•
W bakteriach możemy z powodzeniem klonować
(powielać) geny prokariotyczne i eukariotyczne
.
Jako wektorów do klonowania
molekularnego w mikroorganizmach
używa się:
1. Plazmidów
2. Bakteriofagów
3. Kombinacji elementów genetycznych
plazmidowo-fagowych np. kosmidów,
fagemindów, itp.
Cechy dobrego wektora plazmidowego
•Origin replikacji (
nieliczne wektory integracyjne,
wbudowują się do DNA gospodarza, są bardziej
stabilne, mają mniejszą ilość kopii
)
•Markery selekcyjne (
czyli geny kodujące białka
odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy
fenotypowe. Wektor musi być tak skonstruowany aby
istniała możliwość selekcji tych komórek , do których
wniknął.
•MCS (polilinker)
Pozwala to na swobodniejszy
dobór odpowiedniego do klonowania enzymu
•Wektor powinien być niezdolny do
przeżycia poza komórką gospodarza,
namnażać się w niewielu szczepach
(mały zakres gospodarza), nie posiadać
zdolności koniugacyjnych.
•Powinien być stosunkowo niewielki
(poniżej 10 kpz)