Chomik chiŃski
(
Circetulus griseus)
pochodzi z terenów pustynnych północnych Chin i Mongolii. Po
raz pierwszy zastosowano chomiki chińskie do badań medycznych w 1919 roku.
Jednym z ważnych powodów było wykrycie, że chomiki chińskie są nosicielami pasożyta
Laishmania
,
wywołującego u ludzi chorobę zwaną leiszmaniozą (kala-azar, czarna febra, gorączka dum-dum).
W 1948 roku dwóch amerykańskich naukowców przemyciło chomiki chińskie do USA. Badacze ci
zostali uznani przez chińską komisję do spraw badania zbrodni wojennych za amerykańskich
dywersantów i oskarżeni i popełnienie „zbrodni wojennej”.
W połowie XX wieku krzyżując wsobnie chomiki otrzymano osobniki cierpiące na rozmaite
schorzenia genetyczne. Wykryto również, że chomik chiński ma znaczniej mniej chromosomów niż
człowiek (2n = 22).
W roku 1957 udało się wyprowadzić stabilne linie komórkowe z jajnika chomików. Linie te stały się
cennym narzędziem do badań genetycznych, a zwłaszcza mechanizmów powstawania aberracji
chromosomowych.
Otrzymane stabilne linie komórkowe m.in. wykorzystano do badań mutagenezy. Jednym ze skutków
tych badań było otrzymanie linii pochodnych, ze zmutowanym (unieczynnionym) genem DHFR.
Gen DHFR koduje
reduktazĘ dihydrofolianu
.
DHFR jest niewielkim enzymem, który katalizuje konwersję kwasu foliowego do tetrahydrofolianu
(THF). THF jest konieczny, jako koenzym w rozmaitych procesach biosyntetycznych, a w
szczególności w syntezie glicyn, puryn i tymidyny.
Reduktaza dihydrofolianowa
NADPH + H
+
NADP
+
Reduktaza dihydrofolianowa
NADPH + H
+
NADP
+
Kwas foliowy
DH
2
-folian
TH4-folian
Ponieważ komórki CHO zawierające zmutowany gen DHFR wymagają do wzrostu glicyny,
hipoksantyny i tymidyny można tę właściwość wykorzystać w badaniach selekcyjnych.
Jeśli komórki ze zmutowanym genem DHFR transfekuje się plazmidami zawierającymi prawidłową
formę genu DHFR, wtedy pozytywne transfektanty można wyselekcjonować hodując komórki w
pożywce niezawierającej hipoksantyny i tymidyny.
Ponadto, w komórkach CHO z defektem genu DHFR można łatwo osiągnąć amplifikację
wklonowanego plazmidowego DNA. W tym celu komórki hoduje się w obecności metotreksatu.
Metotreksat jest analogiem kwasu foliowego, inhibitorem blokującym aktywność DHFR.
Dodanie metotreksatu do komórek ze zmutowanym genem DHFR (
ale transferowanych plazmidem
zawierajĄcym funkcjonalny gen DHFR
) zmusza komórki do poradzenia sobie z obniżoną (
przez
hamujĄcy wpływ metotreksatu)
ilością produktu genu DHFR.
Komórki przeciwdziałają obniżeniu poziomu DHFR poprzez amplifikację plazmidu kodującego gen
DHFR.
1
2. Metotreksat
1
. Kwas foliowy
WłaŚciwoŚci komórek CHO:
ci komórek CHO:
Komórki CHO mają liczne cechy, jakich
otrzymywać rekombinowane białka terapeutyczne.
cechy, jakich oczekuje się od komórek, w których zamierza si
rekombinowane białka terapeutyczne.
od komórek, w których zamierza się
1)
Są komórkami eukariotycznymi, w których zachodzi proces glikozylacji białek bardzo
zbliżony do glikozylacji zachodz
2)
Spośród licznych wirusów (badano 44, w tym: HIV, wirus grypy, polio, opryszczki,
etc.), które są dla człow
CHO.
3)
Wymagania wzrostowe komórek CHO nie s
wzrostu w pożywkach niezawieraj
4)
Można adaptować komórki CHO do wzrostu w zawiesinie (np. li
wzrostu w dużej gęstości.
5)
Transfekowanie komórek plazmidami nie nastr
6)
Manipulowanie genetyczne w odniesieniu do komórek CHO nie nastr
trudności.
7)
Jednym z istotnych ogranicze
chińskiego.
komórkami eukariotycznymi, w których zachodzi proces glikozylacji białek bardzo
ony do glikozylacji zachodzącej w ludzkich komórkach.
ród licznych wirusów (badano 44, w tym: HIV, wirus grypy, polio, opryszczki,
dla człowieka patogenami, żaden ni Ema zdolności replikacji w komórkach
komórkami eukariotycznymi, w których zachodzi proces glikozylacji białek bardzo
ród licznych wirusów (badano 44, w tym: HIV, wirus grypy, polio, opryszczki, świnki
ci replikacji w komórkach
Wymagania wzrostowe komórek CHO nie są zbyt złożone. Można adaptowa
ywkach niezawierających surowicy.
komórki CHO do wzrostu w zawiesinie (np. linia „Freestyle Max”), oraz do
ści.
Transfekowanie komórek plazmidami nie nastręcza znaczących trudności.
Manipulowanie genetyczne w odniesieniu do komórek CHO nie nastr
na adaptować komórki do
nia „Freestyle Max”), oraz do
ści.
Manipulowanie genetyczne w odniesieniu do komórek CHO nie nastręcza znacznych
Jednym z istotnych ograniczeń jest brak pełnej wiedzy o sekwencji genom chomika
k pełnej wiedzy o sekwencji genom chomika
2
Pierwszym rekombinowanym lekiem białkowym otrzymanym w komórkach CHO był tkankowy
aktywator plazminogenu (r-tPA, Activase), dopuszczony do obrotu w 1987 roku.
Pierwszym rekombinowanym lekiem białkowym otrzymanym w komórkach CHO był tkankowy
tPA, Activase), dopuszczony do obrotu w 1987 roku.
Pierwszym rekombinowanym lekiem białkowym otrzymanym w komórkach CHO był tkankowy
Problemy zwiĄzane ze stabiln
ekspresyjnymi. Efekt pozycji.
zane ze stabilnĄ transfekcjĄ eukariotycznych komórek plazmidami
ekspresyjnymi. Efekt pozycji.
eukariotycznych komórek plazmidami
Udana integracja transgenu z genomem gospodarza zale
struktury chromatyny w okolicy miejsca integracji.
Udana integracja transgenu z genomem gospodarza zależy gł. od
struktury chromatyny w okolicy miejsca integracji.
Większość
chromatyny
eukariontów
ma
strukturę
heterochromatyny, transkrypcyjnie nieaktywnej.
ypcyjnie nieaktywnej.
Jeśli stosuje się konwencjonalne wektory ekspresyjne i standardow
integracji zachodzi w regionach nieaktywnych transkrypcyjnie. Sytuacja ta powoduje,
ekspresji trans genów, a co za Tm idzie
konwencjonalne wektory ekspresyjne i standardową metodą transfekcji wi
integracji zachodzi w regionach nieaktywnych transkrypcyjnie. Sytuacja ta powoduje,
ekspresji trans genów, a co za Tm idzie wydajność syntezy rekombinacyjnego białka jest niska.
ą transfekcji większość
integracji zachodzi w regionach nieaktywnych transkrypcyjnie. Sytuacja ta powoduje, że wydajność
syntezy rekombinacyjnego białka jest niska.
Ponadto w miarę wzrostu komórek i ich kolejnych podziałów, mo
inaktywacji transgenu, lub szybszego wzrostu komórek nieprodukuj
aktywnych transgenicznie. Ostatecznym skutkiem tych efektów jest niska wydajno
produktu.
wzrostu komórek i ich kolejnych podziałów, może dochodzi
inaktywacji transgenu, lub szybszego wzrostu komórek nieprodukujących transgenu ni
nie. Ostatecznym skutkiem tych efektów jest niska wydajno
e dochodzić do całkowitej
cych transgenu niż komórek
nie. Ostatecznym skutkiem tych efektów jest niska wydajność otrzymanego
Zapobieganie inaktywacji transkrypcji transgenu. Sekwencje insulatorowe
(izolujĄce).
Zapobieganie inaktywacji transkrypcji transgenu. Sekwencje insulatorowe
Zapobieganie inaktywacji transkrypcji transgenu. Sekwencje insulatorowe
Na transgen włączony w genom gospodarza mog
oddziaływać zarówno pozytywnie jak i negatywnie elementy
regulatorowe znajdujące się czasem w znacznych
odległościach od miejsca integracji transgenu.
czony w genom gospodarza mogą
zarówno pozytywnie jak i negatywnie elementy
czasem w znacznych
ciach od miejsca integracji transgenu.
elementy regulatorowe. Te struktury (sekwencje DNA) nazywane s
insulatorami
. Najlepiej poznaną
Drosophila melanogaster.
`
W chromatynie eukariontów wykryto struktury chromatynowe
chroniące niektóre geny przez przypadkow
inaktywacją lub inaktywacją wywołan
Te struktury (sekwencje DNA) nazywane są
sekwencjami izoluj
. Najlepiej poznaną sekwencją izolującą jest sekwencja izolująca otaczaj
W chromatynie eukariontów wykryto struktury chromatynowe
ce niektóre geny przez przypadkową aktywacją lub
wywołaną przez odległe
sekwencjami izolujĄcymi
lub
ąca otaczająca geny
hsp
Jedną ze strategii ochrony transgenu przez negatywnymi
integracji jest włączenie w plazmid sekwencji insulatorowych/izoluj
ze strategii ochrony transgenu przez negatywnymi skutkami chromatyny otaczaj
czenie w plazmid sekwencji insulatorowych/izolujących.
skutkami chromatyny otaczającej miejsce
Zastosowanie insulatorów:
torów:
Otoczenie transgenu sekwencjami izoluj
klonach komórek zawierających stabilnie wbudowany transgen zachodzi z podobn
Otoczenie transgenu sekwencjami izolującymi powoduje, że ekspresja transgenu w rozmaitych
cych stabilnie wbudowany transgen zachodzi z podobną
e ekspresja transgenu w rozmaitych
cych stabilnie wbudowany transgen zachodzi z podobną wydajnością.
Jeśli w wektorze ekspresyjnym nie umieszcza si
kodującym zrekombinowane białko, to wi
badane białko z różną wydajnością
li w wektorze ekspresyjnym nie umieszcza się sekwencji insulatorowych przed i po genie
cym zrekombinowane białko, to większość komórek, które włączyły transgen syntetyzuje
ścią.
owych przed i po genie
czyły transgen syntetyzuje
3
eukariontów
Schematyczny model funkcjonowania regionów przyczepu do macierzy j
(MAR).
Schematyczny model funkcjonowania regionów przyczepu do macierzy j
Schematyczny model funkcjonowania regionów przyczepu do macierzy jĄdrowej
Aktywacji transkrypcji towarzyszy zakotwiczenie si
w macierzy jądrowej.
owarzyszy zakotwiczenie się
sekwencji MAR
(
matrix atachements regions
matrix atachements regions
)
W efekcie powstają pętle chromatyny, które s
transkrypcję wpływu otaczającej chromatyny (innej p
tle chromatyny, które są chronione od stymulującego lub hamuj
ącej chromatyny (innej pętli).
ącego lub hamującego
Maszyneria transkrypcyjna formuje si
MAR z macierzą zbliża do siebie elementy
Maszyneria transkrypcyjna formuje się w miejscu przyczepu do macierzy jądrowej. Oddziaływanie
siebie elementy układu transkrypcyjnego.
ądrowej. Oddziaływanie
Otoczenie genu kodującego terapeutyczne białko sekwe
transgenu w okolicę przyczepu chromatyny do macierzy j
transkrypcyjnego.
cego terapeutyczne białko sekwencjami MAR zwiększa szans
przyczepu chromatyny do macierzy jądrowej i utworzenia kompleksu
ększa szansę integracji
drowej i utworzenia kompleksu
Zastosowanie sekwencji UCOE:
Zastosowanie sekwencji UCOE:
Najnowszą strategią minimalizowania efektu pozycji jest otaczanie trans genów sekwencjami UOCE
(Ubiquitous Chromatin Opening
minimalizowania efektu pozycji jest otaczanie trans genów sekwencjami UOCE
(Ubiquitous Chromatin Opening Element).
minimalizowania efektu pozycji jest otaczanie trans genów sekwencjami UOCE
Pomysł powstał w wyniku analizy struktury regionów chromatyny, w których znajduj
transkrybowane, kodujące białka stale wykorzystywane do zabezpieczania podstawowych funkcji
komórki.
Pomysł powstał w wyniku analizy struktury regionów chromatyny, w których znajduj
ce białka stale wykorzystywane do zabezpieczania podstawowych funkcji
Pomysł powstał w wyniku analizy struktury regionów chromatyny, w których znajdują się geny stale
ce białka stale wykorzystywane do zabezpieczania podstawowych funkcji
Geny te znane są pod angielską
znajdują się także sekwencje DNA, które nadaj
zachodzenie w tym obszarze chromatyny ci
pod angielską nazwą „house-keeping genes”. Okazało się, że w regionach gdzie
e sekwencje DNA, które nadają chromatynie cechę „otwartości”, a wi
zachodzenie w tym obszarze chromatyny ciągłej aktywnej transkrypcji.
ę, że w regionach gdzie
ści”, a więc umożliwiają
Włączenie do wektora ekspresyjnego sekwe
wtedy, jeśli zostanie włączony w region znajduj
regionie centromerowym.
czenie do wektora ekspresyjnego sekwencji UOCE powoduje, że transgen jest aktywny nawet
czony w region znajdujący się w obszarze heterochromatyny, w tym tak
e transgen jest aktywny nawet
w obszarze heterochromatyny, w tym także w
4
KorzyŚci technologii UCOE:
ó
znacznie większa częstość powstawania klonów ekspresyjnych niż w przypadku transfekcji
komórek wektorami niezawierającymi UCOE;
ó
wysoka wydajność otrzymywania produktu bez konieczności stosowania etapu amplifikacja
matrycy;
ó
skrócenie czasu i objętości hodowli;
ó
stabilność ekspresji transgenu aż do ponad 100 generacji komórek;
ó
sekwencje UCOE nie są zbyt długie, co pozwala na konstruowanie plazmidów mogących kodować
równocześnie dwa białka (np. przeciwciała);
ó
znacząco poprawia się standard wielkoskalowej (przemysłowej) produkcji białek
rekombinowanych oraz bardzo znacząco obniża się koszty produkcji.
Poprawa warunków wzrostu komórek CHO:
W celu poprawy wydajności oraz minimalizowania kosztów otrzymywania żądanego białka mogą być
stosowane następujące zabiegi:
1)
Modyfikowanie składu pożywki.
2)
Genetyczne modyfikowanie komórek poprzez
wprowadzenie genów koduj
ą
cych białka
antyapoptyczne
, np.:
a.
gen EIB19K adenowirusa kodujący białko o właściwościach podobnych do białka BcL2
b.
gen kodujący białko Aven hamujące aktywację kaspaz.
Oba białka powodują przedłużenie czasu życia komórek o 1-2 dni, natomiast ich wspólna
ekspresja wydłuża czas życia komórek o 3 dni. Efektem działania obu białek
antyapoptycznych jest zwiększenie wydajności produkcji o ok. 40-50%.
3)
Zwiększanie poziomu białek czaperonowych.
Kontrola proliferacji komórek CHO:
Jednym z zabiegów zmierzających do zwiększenia wydajności otrzymywania białek rekombinowanych w
komórkach smacznych (w tym gł. CHO) jest jak najdłuższe zarzymanie komórek w cyklu komórkowym w
fazie G1, która jest fazą produkcyjną.
Dokonuje się tego gł. poprzez np.:
1.
Wtransfekowanie genu kodującego inhibitor cyklu komórkowego p21
CIP
, pod kontrolą
indukowanego promotora. Po wyhodowaniu dostatecznej ilości komórek aktywuje się gen białko
p21, co powoduje zwolnienie podziałów komórkowych poprzez zatrzymanie komórek w fazie G1,
natomiast procesy syntezy biegną dalej. Ten zabieg może zwiększyć wydajność syntezy
produkowanego białko kilkukrotnie.
2.
Stosowanie niskocząsteczkowych stymulatorów wzrostu Najczęściej stosowany jest maślan sodu
będący inhibitorem deacylazi histonów. Dodatek do pożywki maślanu sodu przedłuża czas w
jakim chromatyna znajduje się w stanie „otwartym”. Przy zastosowaniu maślany sodu należy mieć
na uwadze, że związek ten także może (w zależności od komórek, składu pożywki i innych
okoliczności) przyspieszyć apoptozę.
3.
Obniżanie temperatury hodowli komórek. Na ogół obniża się temperaturę z 37 do 30-32˚C.
5