Marianna Kiszka, Grzegorz Buszewicz, Roman Mądro
Złożone zatrucie środkami psychoaktywnymiComplex intoxication with psychoactive agentsZ Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w LublinieKierownik: prof. dr hab. R. MądroMłody mężczyzna wstrzyknął sobie dożylnie (ze skutkiem śmiertelnym) petydynę, fentanyl i midazolam. Stężenia midazolamu i fentanylu we krwi były niskie (odpowiednio 280 ng/ml i 8 ng/ml). Natomiast stężenie petydyny we krwi (7,7 m g/ml) znacznie przekraczało poziomy uznawane za toksyczne. Wysokie stężenie petydyny stwierdzono również w moczu (91,2 m g/ml), a jej stężenia w narządach przedstawiały się następująco: nerka - 20,2 m g/g, wątroba - 12,9 m g/g, mózg - 4,6 m g/g, żołądek - 2,5 m g/g, jelito cienkie - 0,9 m g/g, jelito grube - 1,3 m g/g.
The paper presents a case of fatal intoxication following intravenous administration of drugs used in premedication: pethidine, fentanyl and midazolam. The identification and quantitative analysis of these drugs was performed using: thin-layer chromatography (TLC), ultraviolet spectrophotometry (UV) and high performance liquid chromatography (HPLC). The concentrations of midazolam and pethidine determined in blood were low (280 ng/ml and 8 ng/ml, respectively) while the pethidine concentration (7.7 ug/ml) was significantly higher than toxic levels. A high level of pethidine was also found in urine (91.2 ug/ml) and its levels in organs were as follows: kidneys - 20.2 ug/g, liver - 12.9 ug/g, brain - 4.6 ug/g, stomach - 2.5 ug/g, small intestine - 0.9 ug/g and large intestine - 1.3 ug/g. Moreover, the following derivatives of 1,4- benzodiazepine: diazepam, oxazepam and nordazepam were found in blood (therapeutic levels).
Słowa kluczowe: petydyna, fentanyl, midazolam, materiał sekcyjnyKey words: pethidine, fentanyl, midazolam, autopsy materialW praktyce medyczno-sądowej coraz częściej odnotowuje się przypadki zatruć mieszaniną leków, które stanowią trudny problem analityczny. Wynika on z konieczności rozdzielenia wielu leków występujących niekiedy w niskich stężeniach oraz z trudności interpretacyjnych, ponieważ teoretycznie możliwe jest zarówno ich antagonistyczne, jak i synergistyczne oddziaływanie.
W pracy opisano przypadek zatrucia po wstrzyknięciu dożylnym leków stosowanych do premedykacji: petydyny, fentanylu i midazolamu.
Petydyna to syntetyczny lek opioidowy o ośrodkowym działaniu podobnym do morfiny. Przy podaniu pozajelitowym szybko pojawia się efekt przeciwbólowy (po ok. 10 min.), utrzymuje się on jednak krócej (do 4 godzin) i wymaga stosowania 8-10-krotnie większych dawek niż w przypadku morfiny (10).
Fentanyl jest syntetycznym środkiem narkotycznym o budowie chemicznej zbliżonej do petydyny. Wykazuje bardzo szybkie (2-3 min. po podaniu dożylnym) lecz krótkotrwałe (30-60 min.) działanie przeciwbólowe, 80-100 razy większe niż morfiny. Wywiera silny depresyjny wpływ na ośrodek oddechowy (10, 15).
Midazolam jest imidazolową pochodną 1,4-benzodiazepiny, o szybkim i silnym działaniu typowym dla leków tej grupy. Okres półtrwania rzędu 1,5-2,5 godz. może być znacznie przedłużony (nawet do 20 godzin) u osób w ciężkim stanie ogólnym. Stosowanie razem z analgetykami opioidowymi nasila działanie uspokajające i może prowadzić do wystąpienia depresji oddechowo-krążeniowej (10, 16).
Opis przypadku
Przy zwłokach 40-letniego mężczyzny znaleziono puste opakowania leków: Dormicum (midazolamu), Dolarganu (petydyny) i Fentanylu oraz strzykawki wraz z igłami do iniekcji.
Badanie pośmiertne przeprowadzone w Zakładzie Medycyny Sądowej AM w Lublinie nie wykazało takich zmian makroskopowych i mikroskopowych, które wyjaśniałyby przyczynę zgonu. We krwi nie stwierdzono obecności alkoholu etylowego.
Materiał i metody
Badaniom toksykologicznym poddano materiał pobrany podczas sekcji zwłok (krew, mocz oraz wycinki narządów wewnętrznych: żołądka, wątroby, nerki, mózgu, jelita cienkiego i grubego), a także materiał dowodowy zabezpieczony w miejscu znalezienia zwłok.
Do izolacji trucizn z wycinków narządów wewnętrznych zastosowano ekstrakcję typu ciecz-ciecz w systemie ciągłym: eterowo-kwaśną i chloroformowo-alkaliczną, po uprzednim odbiałczeniu tkanek metodą siarczanowo-amonową wg Borkowskiego (1). Mocz ekstrahowano bezpośrednio eterem w środowisku kwaśnym, a następnie chloroformem ze środowiska alkalicznego. Dodatkowo próbki moczu, wątroby i nerki poddano hydrolizie przy użyciu kwasu solnego, a następnie ekstrakcji ze środowiska zasadowego eterem oraz mieszaniną chloroform-izopropanol (3-1). Krew ekstrahowano mieszaniną dichlorometan-eter etylowy (1-1) w środowisku alkalicznym.
Strzykawki oraz igły do iniekcji przepłukiwano etanolem.
Do analizy eluatów ze strzykawek oraz ekstraktów z materiału biologicznego w kierunku obecności środków farmakologicznych, zwłaszcza leków znalezionych przy zwłokach, zastosowano metody: chromatografii cienkowarstwowej (TLC), spektrofotometrii w nadfiolecie (UV) oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
W metodzie TLC zastosowano płytki Merck DC-Alufolien 60F254 oraz różne układy rozwijające i wywołujące (2,5,17). Do rozdziału leków ujawnionych przy zwłokach (petydyny, fentanylu i midazolamu) wybrano 3 fazy ruchome: metanol-woda amoniakalna 25% (100-1,5) chloroform-metanol (9-1) i octan etylu-metanol-woda amoniakalna 25%-woda (86-10-1-3).
Analizę spektrofotometryczną przeprowadzono przy użyciu aparatu Cecil CE 7200 w zakresie 200-350 nm.
Do badań identyfikacyjnych oraz ilościowych zastosowano metodę HPLC (chromatograf cieczowy f-my Gilson; dwie kolumny: Hypersil ODS 250x4,0 mm, 5m m i LiChroCART RP-18 250x4,0 mm, 5m m; faza ruchoma: acetonitryl (An) - 0,025 M kwas o-fosforowy z dodatkiem 0,5% trietylaminy o pH 3 (Kf) - w proporcjach 30-70 oraz 20-80, w systemie dwóch pomp; przepływ eluentu 1,5 ml/min.; objętość wstrzykiwanej próbki - 10 m l; detekcja - 220 i 240 nm). Stężenia ksenobiotyków oznaczano metodą standardu zewnętrznego z odpowiednich krzywych kalibracji - według oprogramowania Gilson 715 HPLC System. Ekstrakty z krwi wprowadzano bezpośrednio do kolumny chromatograficznej, natomiast w przypadku ekstraktów z moczu i tkanek analizowano etanolowe eluaty ze stref chromatograficznych TLC o wartościach Rf odpowiednich dla oznaczanych leków.
Wyniki i omówienie
W eluatach ze strzykawek (metodą TLC i HPLC) wykryto petydynę, midazolam i fentanyl.
Układy rozwijające, które nadają się do rozdziału tych leków metodą TLC zestawiono (wraz z wartościami Rf) w tab. I. Natomiast ryc. 1 przedstawia chromatogramy TLC zasadowych ekstraktów z materiału sekcyjnego w wymienionych trzech układach rozwijających. Wynika z niej, że chociaż wszystkie trzy układy dobrze rozdzielały midazolam, petydynę i fentanyl, to jednak ich użyteczność do analizy tych leków w ekstraktach z materiału biologicznego była różna (ryc. 1 i tab. I). Zdecydowanie najlepszy do rozdziału w/w leków od tła biologicznego był układ III (octan etylu-metanol-woda amoniakalna 25%-woda 86-10-1-3), gdyż plamy tła położone były poniżej plam badanych leków. Układ ten zastosowano więc do oczyszczania alkalicznych ekstraktów z moczu i tkanek przed ilościowym oznaczeniem leków metodą HPLC.
Przy użyciu metody TLC stwierdzono jednak tylko petydynę. Stężenia pozostałych leków tj. midazolamu i fentanylu były zbyt niskie, aby można je było wykryć tą metodą. Powszechnie stosowana identyfikacja pochodnych benzodiazepiny met. TLC za pomocą kwaśnej hydrolizy i bardzo czułej reakcji Bratton-Marshalla w odniesieniu do midazolamu nie mogła być użyta, gdyż czteropierścieniowe benzodiazepiny nie ulegają przemianom do benzofenonów (3, 4, 17). Jednak (po zastosowaniu dwóch układów rozwijających: benzen i chloroform-aceton 4-1 oraz wybarwiania przez dwuazowanie i sprzęganie z N-naftyloetylenodiaminą) w eterowych ekstraktach z moczu, wątroby i nerki (poddanych uprzednio kwaśnej hydrolizie) wykazano 2-amino-5-chlorobenzofenon, co pośrednio wskazywało na obecność także innych niż midazolam pochodnych 1,4-benzodiazepiny.
Tabela I. Wyniki rozdziału petydyny, fentanylu, midazolamu oraz "tła" materiału sekcyjnego metodą chromatografii ienkowarstwowej.
Table I. Results of separation of pethidine, fentanyl, midazolam and "background" of postmortem material by means thin-layer chromatography method.
Układ
rozwijający
Development phase
wartości Rf x 100
Rf x 100 value
Petydyna
Pethidine
Midazolam
Midazolam
Fentanyl
Fentanyl
Tło ekstraktu
z tkanek
Background of tissue extract
I
54
65
72
57, 60, 66
II
22
43
64
17, 38, 51
III
51
57
78
14, 32, 38
Układ I: metanol-woda amoniakalna 25% 100-1,5,
Układ II: chloroform-metanol 9-1,
Układ III: octan etylu-metanol-woda amoniakalna 25%-woda 86-10-1-3.
System wywołujący: A. odcz. Dragendorffa i 10% kw. siarkowy,
B. jodoplatynian potasowy i 10% kw. siarkowy.
Phase I: methanol-ammonia 25% 100-1,5
Phase II: chloroform-methanol 9-1
Phase III: ethyl acetate-methanol-ammonia 25%-water 86-10-1-3
Location reagents: A. Dragendorff and 10% H2SO4
B. Iodoplatinate potassium and 10% H2SO4
Zastosowanie metody spektrofotometrii w UV dało wynik pozytywny również tylko dla ekstraktów z dużą zawartością petydyny (z moczu, nerki, wątroby i krwi), po uprzednim ich oczyszczeniu metodą TLC, co przedstawiono na ryc. 2.
Identyfikacja pozostałych leków (midazolamu i fentanylu) była możliwa tylko po zastosowaniu metody HPLC. Na obu kolumnach uzyskano dobry rozdział wszystkich trzech poszukiwanych substancji, a także wykrytych dodatkowo innych leków z grupy 1,4-benzodiazepiny tj. diazepamu, oksazepamu i nordazepamu. Wartości czasów retencji badanych leków w optymalnych warunkach rozdziału chromatograficznego zestawiono w tabeli II, natomiast ryciny 3 i 4 przedstawiają chromatogramy HPLC ekstraktów z krwi w dwu optymalnych proporcjach składników fazy ruchomej: An- Kf 30-70 i 20-80.
Faza ruchoma o składzie An-Kf 30-70 wprawdzie rozdzielała wszystkie z sześciu zidentyfikowanych ksenobiotyków (ryc. 3), jednak pik petydyny częściowo pokrywał się z pikami tła krwi. Zmiana w proporcjach składników fazy ruchomej do 20-80 pozwoliła na wyeliminowanie wpływu tła i ilościową interpretację pików petydyny (ryc. 4). Wysoki odzysk tego leku z krwi (76,7 ą 7,5%, n=3) i czułość detekcji równa 25 ng w nastrzyku umożliwiała proste i szybkie oznaczenie nawet terapeutycznych poziomów petydyny czyli do 0,2-0,4 m g/ml (z 1 ml krwi, objętość końcowa ekstraktu 0,05-0,1 ml).
Ryc. 1. Chromatogramy TLC ekstraktów z materiału sekcyjnego. Systemy rozwijające: I. metanol-amoniak 25% (100-1,5), II. chloroform-metanol (9-1), III. octan etylu-metanol-amoniak 25%-woda (86-10-1-3). Systemy wywołujące: A. odcz. Dragendorffa i 10% kw. siarkowy, B. jodoplatynian potasowy i 10% kw. siarkowy. 1. Petydyna wz., 2. Midazolam wz., 3. Fentanyl wz., 4. Krew, 5. Mocz, 6. Żołądek, 7. Wątroba, 8. Nerka, 9. Jelito cienkie, 10. Jelito grube, 11. Mózg, 12. Tło wątroby, 13. Mieszanina wzorców: petydyny, midazolamu i fentanylu.
Fig. 1. TLC chromatograms of postmortem material extracts. Development systems: I: methanol-ammonia 25% (100-1,5), II: chloroform-methanol 9-1 III: ethyl acetate-methanol-ammonia 25%-water (86-10-1-3) Location reagents: A. Dragendorff and 10% H2SO4 B. Iodoplatinate potassium and 10% H2SO4 1. Pethidine, 2. Midazolam, 3. Fentanyl, 4. Blood, 5. Urine, 6. Stomach, 7. Liver, 8. Kidney, 9. Small intestine, 10. Large intestine, 11. Brain, 12. Background of liver, 13. Mixture of standards: Pethidine, Midazolam and Fentanyl.
Ryc. 2. Widma UV petydyny w ekstraktach z materiału sekcyjnego po rozdziale metodą TLC.
Fig. 2. Pethidine UV spectra of postmortem material extracts after separation by means TLC method.
Również ilościowe oznaczenie midazolamu we krwi w opisanych warunkach izolacji i rozdziału chromatograficznego nie nastręczało trudności. Limit wykrywalności met. HPLC wynosił 5 ng midazolamu w próbce wprowadzonej do kolumny chromatograficznej, co przy wysokiej wydajności ekstrakcji tego leku z krwi (82,7 ą 5,1%, n=3) dawało czułość oznaczenia rzędu 0,05-0,10 m g/ml, zależnie od objętości końcowej ekstraktu z krwi. Podczas oznaczania midazolamu w osoczu inni autorzy uzyskiwali znacznie niższe limity detekcji (8), zwłaszcza przy użyciu metody GC-MS (13) lub LC-MS (12). Biorąc jednak pod uwagę, że terapeutyczny zakres stężeń midazolamu we krwi mieści się w granicach 0,07-0,37 m g/ml (zależnie od drogi podania i dawki) (5, 6), a w przypadku przedawkowania midazolamu jego poziom w próbkach krwi pobranych przyżyciowo i pośmiertnie wynosił odpowiednio 2,8 oraz 2,4 m g/ml (14), należy uznać, iż opisane wyżej postępowanie analityczne może być w pełni użyteczne do oznaczania tego leku we krwi sekcyjnej.
Ryc. 3. Chromatogramy HPLC ekstraktów z krwi. Faza ruchoma: acetonitryl-kw. fosforowy 30-70, v/v; prędkość przepływu 1,5 ml/min.; detekcja UV 220 nm. Pet - petydyna, Fen - fentanyl, Mid - midazolam, Ox - oksazepam, Nor - nordazepam, Dia - diazepam.
Fig. 3. HPLC chromatograms of blood extracts. Mobile phase: actonitrile-phosphoric acid 30-70 v/v; flow 1,5 ml/min.; UV detection 220 nm. Pet - Pethidine, Fen - Fentanyl, Mid - Midazolam, Ox - Oxazepam, Nor - Nordazepam, Dia - Diazepam.
Ryc. 4. Chromatogramy HPLC ekstraktów z krwi. Faza ruchoma: acetonitryl-kw. fosforowy 20:80, v/v; prędkość przepływu 1,5 ml/min.; detekcja UV 220 nm.
Fig. 4. HPLC chromatograms of blood extracts. Mobile phase: actonitrile-phosphoric acid 20-80 v/v; flow 1,5 ml/min.; UV detection 220 nm.
Procedura analityczna zastosowana z powodzeniem do wykrycia i określenia stężenia midazolamu okazała się nieskuteczna w przypadku fentanylu. Odzysk fentanylu z krwi był wprawdzie wyższy niż midazolamu (93,3 ą 3,7%, n=3), ale czułość detekcji w metodzie HPLC była niższa - 10 ng w nastrzyku. Wykazanie tego leku w badanej krwi było możliwe dopiero po analizie ekstraktu z 10 ml krwi, oczyszczonego metodą TLC (ryc. 5). Oznaczony w ten sposób poziom fentanylu wynosił 8 ng/ml krwi.
Ryc. 5. Chromatogram HPLC eluatu ze strefy fentanylu (po oczyszczeniu ekstraktu z krwi metodą TLC). Faza ruchoma: acetonitryl-kw. fosforowy 30-70, v/v; prędkość przepływu 1,5 ml/min.; detekcja UV 220 nm.
Fig. 5. HPLC chromatogram of Fentanyl zone (after separation of blood extract by means TLC method). Mobile phase: actonitrile-phosphoric acid 30-70 v/v; flow 1,5 ml/min.; UV detection 220 nm.
Tabela II. Wartości czasów retencji (tr w min.) leków oznaczanych metodą HPLC.
Table II. Retention time (tr, min) of drugs by means HPLC method.
Faza ruchoma*
Mobile phase
Kolumna**
Column
Petydyna
Pethidine
Fentanyl
Fentanyl
Midazolam
Midazolam
Oksazepam
Oxazepam
Nordazepam
Nordazepam
Diazepam
Diazepam
Tło ekstraktu
z krwi
Background of blood extract
30-70
a
3,77
7,23
8,88
9,36
15,41
27,68
3,42; 4,51
...